gbt 14926.21-2008 实验动物 兔出血症病毒检测方法

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1、ICS65．020．30B44园宜中华人民共和国国家标准GB／T14926．21—2008代替GB／T14926．212001实验动物兔出血症病毒检测方法Laboratoryanimal--MethodforexaminationofRabbithemorrhagicdiseasevirus(RHDV)2008—12—10发布2009—03-01实施丰瞀嬲紫瓣訾糌瞥星发布中国国家标准化管理委员会仪19刖昂GB／T14926．2卜一2008GB／T14926<<实验动物》共54个部分，为不同微生物和病毒检测技术方法。本部分自实施之日起代替GB／T14

2、926．21—2001《实验动物兔出血症病毒检测方法》。本部分与GB／T14926．2l一200l相比主要技术差异如下：a)增加兔出血症病毒核酸(RHDV)核酸检测方法；b)确定兔免疫接种RHDV疫苗后的血清抗体合格判定标准。本部分由全国实验动物标准化委员会提出并归口。本部分起草单位：全国实验动物标准化技术委员会。本部分主要起草人：贺争鸣、付瑞、田克恭。本部分所代替标准的历次版本发布情况为：——GB／T14926．211994，GB／T14926．212001。实验动物兔出血症病毒检测方法1范围GB／T14926的本部分规定了兔出血症病毒(RHDV

3、)的检测方法。本部分适用于兔RHDV抗原、抗体和病毒核酸的检测。2规范性引用文件GB／T14926．21—2008下列文件中的条款通过GB／T14926的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB／T14926．53实验动物血凝试验GB／T14926．54实验动物血凝抑制试验3原理血凝试验(HA)：在一定条件下，RHDV能凝集人“O”型红细胞，产生可见的凝

4、集反应。根据这一特性检测兔肝组织中有无RHDV抗原。血凝抑制试验(HAI)：在一定条件下，RHDV凝集人“o”型红细胞的能力可被特异性抗体所抑制。根据这一特性检测兔血清中有无RHDV抗体。核酸检测：根据RHDVVP60基因序列保守的特点，设计特异引物，扩增目的片段，检测兔组织中的RHDV核酸。4主要试剂与器材4．1试剂4．1．1血凝素人工感染或自然发病的兔肝组织，经研磨制成10％悬液，3000r／min离心10min而获得的上清液。4．1．2阳性血清RHDV抗原免疫或RHDV自然感染恢复后的兔血清。4．1．3阴性血清无RHDV感染、未经免疫的兔血清

5、。4．1．4人“0”型红细胞。4．1．5缓冲液与溶液4．1．5．1PBS(pH7．4)NaCl8gKCl0．2gNa2HP04·12H202．83gKHzPOt0．2g去离子水1000mL4．1．5．2TRIzolReagent。1GB／T14925．21—20084．1．5．350×TAEBuffer(pH8．5)Tris242g醋酸57．1mLNazEDTA·2H2037．2g去离子水1000mL5．4溴乙锭(10mg／mL)。5．56×LodingBuffer。5．6氨苄青霉素(100mg／mL)。5．7三氯甲烷(分析纯)。5．8乙醇(分析纯

6、)。5．9异丙醇(分析纯)。6酶与缓冲液6．15×AMVRTBuffer，AMVRTase(10U／pL)。6．2RNaseinhibitor(40U／uL)。6．3DEP(、_H：O。6．4随机引物9mers(500pg／mL)。6．5dNTPmixture(2．5mmol／Leach)。6．6MgCl2(25mmol／L)，10×PCRBuffer，TaqDNApolymerase(5U／pL)。7培养基7．1LB培养基tryptone10gyeastextract5gNaCl10g去离子水1000mL4．1．7．2LB／Amptryptone

7、10gyeastextract5gNaCI10gampicillin100pg／mL去离子水1000mL4．1．8琼脂糖凝胶AgaroseL03。4．1．9感受态细胞与载体4．1．9．1适用于所构建克隆载体的大肠杆菌感受态细胞。4．1．9．2DNA片段琼脂糖凝胶纯化试剂盒。4．1．9．3可用于连接PCR产物的商品化T载体。4．1．9．4质粒小量提取试剂盒。4．2器材4．2．1微量振荡器。4．2．2微量血凝反应板(u型或V型)。4．2．3微量加样器(容量0．5pL～10ffL，10ffL～100弘L，20tzL～200p-L，i00卜L～l000pL

8、)。4．2．4生物安全柜。4．2．5冷冻离心机。4．2．6紫外分光光度仪。244．2．7PCR仪。4．2．8电泳仪。4．2