重庆地区兔腹泻病原菌分离鉴定及检测方法的建立

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1、重庆地区兔腹泻病原菌分离鉴定及检测方法的建立许国洋1，沈克飞1，徐登峰1，付利芝1，张素辉1，王孝友1，杨柳1*（1.重庆市畜牧科学院，重庆402460）摘要旨在对重庆地区兔细菌性腹泻病原菌进行分离鉴定并建立相应检测方法，为该病的检测及防控奠定基础。通过临床诊断与细菌分离培养技术，对引起兔腹泻的病原菌进行分离，利用细菌16SrDNA通用引物扩增分离菌16SrDNA基因序列，测序分析后，构建系统进化发育树。同时，依据各病原菌特异性序列设计引物，建立PCR检测方法。结果表明，共分离到4种病原菌，分子生物学鉴定

2、后分别确定为：铜绿假单胞菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌；依据铜绿假单胞菌外毒素eta基因、产气荚膜梭菌a毒素基因、金黄色葡萄球菌耐热核酸酶nuc基因和大肠杆菌外膜蛋白eae基因设计特异性引物，成功建立多重PCR检测方法，可从4种病原菌基因组混合物中扩增出大小分别为1043、324、200和609bp的目的条带，对目的菌株最低检出浓度为103cfu·mL-1。对重庆地区200份临床样本进行检测，发现4种病原菌普遍存在，其中，金黄色葡萄球菌单独感染检出率高达37.6%，金黄色葡萄球菌与大肠杆菌混合

3、感染检出率达28%。关键词兔腹泻；病原菌；分离鉴定；多重PCR；混合感染，检出率中图分类号S852.61文献标识码:A收稿日期：2018-02-17修回日期：2018-06-02基金项目：重庆市农业发展基金（16408）；重庆市农业技术推广与服务补助资金项目（14461）第一作者：许国洋，男，助理研究员，主要从事畜禽疫病防控及分子生物学研究。E-mail：guoyangxu@126.com.通讯作者：杨柳，男，副研究员，主要从事畜禽疫病防控及分子生物学研究。E-mail：yangliuldz@163.co

4、m.近年来，随着畜牧业的不断发展，养兔业已成为重庆地区一项发展潜力巨大的产业。但由于重庆地区的独特地理特征和湿热气候环境，为病原菌滋生创造了有利条件，成为疫病多发的主要诱因之一，严重影响养兔业的健康可持续发展。兔腹泻是一类临床上表现腹泻症状的疾病，表现为排粪频繁，粪便稀软，呈粥样或水样便，轻者食欲减退，精神不振，排粪稀软，呈粥样或水样，病兔全身反应较轻，虚弱、消瘦、不爱运动[1-3]；重者体温升高，食欲废绝，精神倦怠，严重腹泻，呈水样常混有血液或胶冻样黏液，粪便恶臭[4]。腹部触诊有明显痛疼反应。呈脱水和

5、衰竭状态及自体中毒症状，结膜发绀，脉博细弱，呼吸促迫，常因虚脱而死亡[5-6]。目前，兔腹泻病在重庆地区有流行趋势，多发于幼兔，给养兔业造成巨大经济损失。兔腹泻病种类多样，病因复杂，其中，由病原菌导致的细菌性腹泻最为重要[7]。兔细菌性腹泻主要包括：大肠杆菌病、产气荚膜梭菌病、泰泽氏菌病、沙门氏菌病、金黄色葡萄球菌病和铜绿假单胞菌病等，其中，以大肠杆菌病和产气荚膜梭菌病发生率较高[8]。由于兔细菌性腹泻各病原菌致病性与耐药性差异，导致其在不同地区呈不同流行趋势，危害也各有差异，给疫病防控带来巨大困扰[9]

6、。因此，明确病原，建立有效检测方法对该病的防控有着重要意义。目前关于兔细菌性腹泻的研究主要是关于其病原特性和防治措施的，有关诊断方法的相对较少[10]。传统病原菌分离鉴定方法费时耗力，成本较高，且易出现漏检，不能达到快速诊断的目的。本研究针对重庆地区兔细菌性腹泻病原菌进行分离鉴定，并建立检测方法，为该病的防控奠定理论基础。1材料与方法1.1试剂细菌基因组提取试剂盒、2×TaqPCRMasterMix、DL-2000Marker、胶回收试剂盒和胎牛血清，均购自天根生化科技(北京)有限公司；参照许国洋[11]

7、的方法设计细菌16srDNA基因序列通用引物，同时，参照铜绿假单胞菌外毒素eta基因[12]、产气荚膜梭菌a毒素基因[13]、金黄色葡萄球菌耐热核酸酶nuc基因[14]和大肠杆菌外膜蛋白eae基因[15]设计特异性引物，引物均由上海生工生物工程有限公司合成，引物信息见表1。表1.引物信息Primerinformation名称Name引物序列Primersequence产物大小/bpProductsize参考基因GenBank登录号GenBankIDofreferencegene细菌通用引物Bacteria

8、universalprimersF:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’R:5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’1500铜绿假单胞菌PseudomonasaeruginosaF：5’-AGTTGGTCGCTGAACTGGC-3’R：5’-TGCATCTCGTTGCTCTCGTG-3’200KC847698.1产气荚膜梭菌ClostridiumperfringensP35’-GCTAATGTTA