犊牛腹泻轮状病毒分离鉴定及rt-lamp检测方法的建立

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1、河北农业大学硕士学位论文犊牛腹泻轮状病毒分离鉴定及RT--LAMP检测方法的建立姓名：李巍申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：孙继国20120526摘要『JOIIPillIIIIIrllllIIIIIIlllllllIillliltY2143123轮状病毒(BovineRotavims，BRV)属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)轮状病毒属(Rotavims)，是引起各种幼龄动物病毒性腹泻的主要病原之一。该病自报道以来，己在全世界主要养牛国家普遍发生和流行，给养牛业造成严重的经济损失。常用检测方法有RT-PCR，ELISA等，可由于需要昂贵的设备和专业人员而不便于在临床普遍应

2、用，所以急需一种方便简单的检测方法。环介导等温扩增技术(100p．mediatedisothermalamplification，LAMP)通过具有链置换特性的BstDNA聚合酶完成靶序列的扩增，仅需恒温就能扩增核酸，并可通过核酸染料染色或者离心沉淀观察结果，较之普通的RT-PCR方法，具有简便、快速的特点。对保定地区发病牛场的犊牛腹泻病料进行处理，得到疑似病毒液，然后将其接种到Marc．145细胞上，37℃C02条件下盲传四代后，细胞出现皱缩、变圆、界限不清晰、崩解等病变。根据GenBank发表的牛轮状病毒VP7基因序列，设计了一对特异性引物。用此引物对出现细胞病变的培养液进行RT-P

3、CR检测，所得目的片段与预期片段长度(342bp)一致。将RT-PCR产物纯化回收，进行克隆转化及序列测定，分析结果与预期的结果相同。对该毒株的理化特性鉴定结果表明：该株牛轮状病毒不耐热，对氯仿、强酸、乙醚有良好的抵抗力。证实本研究分离出的病毒为牛轮状病毒，命名为BD株。本研究将建立检测BRV的RT-LAMP检测方法。根据GenBank中发表的BRV基因序列，用DNAstar进行分析和比对后发现，VP7的基因序列相对保守，故针对VP7进行引物设计。利用PrimerExplorer4．0引物设计软件，严格按照引物设计原则及注意事项进行引物设计，并对设计出的引物进行筛选，最终确定一组，包括外

4、引物F3、B3，内引物FIP、BIP。用此引物对提取好的病毒RNA进行RT-LAMP反应，并对试验反应条件进行优化。结果表明，RT-LAMP最佳反应温度是62℃，反应时间为50min；优化的各组分浓度分别为：M孑+2．5此，dNTPs3．51．tL，BstDNA聚合酶1．5p．L；外引物和内引物最佳浓度比为1：6，即外引物(F3：B3=l：1)共计为1“L，内引物(FIP：BIP=I：1)共计为69L。对经过摸索条件后建立的反应体系进行灵敏度、特异性、重复性和稳定性试验，结果表明，RT-LAMP的敏感性是RT-PCR的100倍；特异性试验结果显示无交叉反应存在，说明该检测技术特异性较好；

5、批间和批内的检测结果无明显差异，说明该检测方法相对稳定，重复性较好。用本试验建立的RT-PCR和RT-LAMP方法对49份样品提取的RNA进行检测后，结果表明两种方法的符合率达到100％。本研究成功建立了BRV的RT-LAMP检测技术。关键词：牛轮状病毒；分离鉴定；环介导等温扩增技术；检测IsolationandIdentificationofPorcineEncephalomyocarditisVirusandDevelopmentofDetectionbyaRT-LAMPMethodAuthor：WeiLiAdvisor：Prof．JiguoSunMajor：PreventiveVe

6、terinaryMedicineAbstraetBovinerotavirusbelongstoReoviridaefamily,Rotavirusgenus．Itismajorpathogenofcalfviraldiarrhea．Thediseasespreadsacrosstheworldandhascausedgreatfinanciallosses．ImPCRandELISA，ascommonlyuseddetectionmethods，arehardlyuniversalinclinicdiagnosisduetotheneedforexpensiveequipmentand

7、professionalresearchers．SoaconvenientandsimpledetectionmethodiSdesperatelyinneed．Loopmediatedisothermalamplification(LAMP)techniqueisanovelnucleicacidamplificationmethodwhichreliesontheBstDNApolymerasetoaccomplishautoc