犊牛腹泻病原菌分离鉴定及药敏试验

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1、犊牛腹泻病原菌分离鉴定及药敏试验国家肉牛牦牛产业技术体系岗位专家邓立新摘要：商丘某肉牛养殖场大量犊牛发生腹泻，为了研究引起犊牛腹泻的病原菌，本试验从商丘某肉牛养殖场无菌采集腹泻犊牛的新鲜粪便，进行细菌的增菌培养、纯化、质谱试验和药敏试验。结果表明，分离的细菌在形态特征、培养特性、生化特性、耐药性等方面与大肠埃希氏菌、沙门氏菌、克雷伯氏菌基本相同，通过质谱鉴定为大肠埃希氏菌、沙门氏菌和克雷伯氏菌。药敏试验结果表明该分离菌对氨卡西林、青霉素等耐药，对环丙沙星、头孢吡肟、恩诺沙星等敏感。试验结果为临床用药及预防提供了理论依据。关键词：犊牛腹泻；细菌分离鉴定；飞行时间质谱；药敏试验犊

2、牛腹泻是新生犊牛常发的一种急性腹泻，引起犊牛腹泻的病因很多，包括细菌、病毒、寄生虫等病原微生物以及营养因素和环境因素等[1]。仅大肠埃希菌病造成的死亡，就占肉用犊牛死亡总数的75%，该病的发生严重影响着犊牛的生长发育和成年后的生产性能，给养牛业造成巨大的经济损失[2]。此外，由于临床中抗菌药物的大量应用，甚至滥用，导致了大肠埃希菌等细菌耐药性的产生和扩散，给犊牛腹泻病的防治造成了一定困难，而且动物源性带耐药质粒的肠道菌可通过畜禽产品的加工、食用等过程传播到人类，对人类健康具有潜在性危害[3]。但由于近年来随着质谱技术的快速发展，软电离方式的出现，基质辅助激光解吸电离飞行时间质

3、谱能够对蛋白质、核酸及脂类等生物大分子进行快速、准确的分析，进而使得其被应用于细菌的检测及鉴定[4-5]。本试验从河南省民权县某肉牛养殖场无菌采集腹泻犊牛粪便病料，进行病原分离，对分离菌株进行分离培养、镜检、生化试验、药敏试验及飞行时间质谱试验，希望为犊牛腹泻病的防治提供依据。1材料与方法1.1材料1.1.1试验地点、时间本试验从2015年1月至4月间在河南农业大学微生物实验室进行。1.1.2病料棉拭子无菌采集民权县某肉牛场腹泻犊牛粪便。1.1.3主要试剂药敏片购自于杭州滨和微生物试剂有限公司，规格为5μg/片、20片/瓶，药敏稀释法所用的药物由河南农业大学提供（青霉素钠、头

4、孢噻呋钠、头孢吡肟、氨卡西林钠、硫酸庆大霉素、泰妙菌素、环丙沙星、恩诺沙星、阿莫西林、盐酸四环素、氟苯尼考、多西环素），药物浓度为512mg/ml；麦康凯培养基（MK），SS琼脂培养基，普通肉汤培养基，普通琼脂培养基，MHB琼脂培养基，三糖铁培养基，以上培养基均按常规方法配制[6]。95%酒精，革兰氏染液，甲基红，1%氢氧化钠溶液等指示剂。1.1.4主要仪器设备显微镜（JnoecXS-212-202）、恒温培养箱、烘干箱、高压灭菌锅、冰箱(海尔)等。1.2方法1.2.1病料处理将采集的病料接种于普通肉汤培养基中在37℃培养箱中培养12～24h。1.2.2细菌的分离培养7将病料

5、接种于普通肉汤培养基中，37℃培养12～24h，待肉汤浑浊后接种于普通琼脂培养基上划线分离得到单个菌落，挑取菌落形态不同的单个菌落接种于普通肉汤培养中，37℃培养12～24h，用接种环从试管中挑取一环进行抹片固定和革兰染色，镜检[7-9]。根据菌体形态及染色特性初步判定细菌种类，各类细菌按相应生化特性做进一步的鉴定。1.2.3细菌的鉴定(1)将革兰染色呈阴性杆菌，接种在麦康凯琼脂培养基、SS培养基、和三糖铁琼脂培养基斜面上，37℃培养12～24h，观察是否符合大肠杆菌、沙门氏菌、克雷伯氏菌的培养特性（2）所分离细菌的24h纯培养物进行甲基红试验／V—P试验、吲哚等生化鉴定试验

6、。1.2.4细菌的Maldi-Tof-Ms（飞行时间质谱）和VITEK（生化鉴定仪）鉴定将纯化好的新鲜菌种从普通肉汤培养基中提取一环在麦康凯培养基中进行划线，37℃培养12～24h，在河南省出入境检验检疫局进行细菌的飞行时间质谱和生化鉴定。1.2.5药敏试验-纸片法（1）测试菌液的制备选取商丘市民权县某肉牛场犊牛粪便中已经鉴定出的大肠杆菌株从保存菌株中提取2～3接种环，接种于含5mL营养肉汤试管中，置37℃恒温培养箱中培养24h。（2）药敏纸片试验用1000μL量程的移液枪从试管中吸取100μL菌液，打入提前制备好的MHB琼脂培养基中，用涂布棒均匀的涂抹使菌液中的水分被培养基

7、完全吸收后方可贴药敏片。用无菌镊子取药敏纸片贴在平板表面，每个平板贴6张纸片，每张纸片间距不少于24mm，外围纸片中心距平皿边缘不少于15mm。将平板放入37℃培养箱中培养12～24h后取出，用直尺测量抑菌圈直径，结果判断依据药敏纸片判定标准。（图1）（3）结果判定标准抑菌效果按照《药理学》中的标准判定，抑菌直径>20mm为极敏感；15～19mm为高度敏感；10～14mm为中度敏感；10mm以下为低敏[6-9]。1.2.6药敏试验-稀释法（1）将保存在肉汤中的菌液划线于麦康凯培养基上培养12～24h，次