黄喉拟水龟腐皮病病原菌的分离鉴定及药敏试验.pdf

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1、动物医学进展。2014，35(9)：127—131ProgressinVeterinaryMedicine黄喉拟水龟腐皮病病原菌的分离鉴定及药敏试验兰云△，胡秀彩△，沈晓静，李雪，吕爱军，朱爱华，冯照军(江苏师范大学生命科学学院，江苏徐州221116)摘要：分离鉴定黄喉拟水龟腐皮病致病菌，以了解其致病性和药敏特性。通过形态学观察、生理生化特性、16srDNA序列扩增及系统发育树分析等方法系统鉴定，并进行动物感染试验、药敏试验。结果从发病黄喉拟水龟体表病灶分离到一株革兰阴性短杆菌，编号为TSM13032菌株，PCR扩增获得16SrDNA序列片段大小为1482bp(登录号：KF611897)，该

2、分离茵与人源类香味菌属(Myroidessp．)参考菌株基因序列同源性达99．92；系统发育树分析表明，TSM13032菌株与Myroidessp．(登录号：JX966100)亲缘关系最近，自然聚类为一支；动物感染试验表明对稚龟有致病性；对氨苄西林、哌拉西林、头孢哌酮、头孢噻吩、头孢孟多、阿奇霉素、萘啶酸、氯霉素、磺胺异恶唑等9种抗生素高度敏感。初步鉴定该菌为类香味菌属新种(Myroidessp．)，首次报道黄喉拟水龟腐皮病病原与类香味茵有关。关键词：黄喉拟水龟；类香味菌；分离鉴定；致病性；药敏试验中图分类号：$855．12文献标识码：B文章编号：1007—5038(2014)09—0127

3、—05黄喉拟水龟(Mauremysmutica)又称石龟、石4．0cm)购自徐州市某花鸟市场，25℃饲养观察1金钱龟、黄板龟、香龟等，隶属于龟科(Emydidae)、拟周，确认健康无病后用于试验。水龟属(Mauremys)，具有较高食用、药用及观赏价1．1．2主要试剂LB培养基、细菌生化鉴定管和值，已被列入《国家保护的有益的或者有重要经济、药敏纸片，杭州微生物试剂有限公司产品；PCR反科学研究价值的陆生野生动物名录》。近年来，黄喉应试剂2×TaqPCRMasterMix，南京诺唯赞生物拟水龟野生资源日趋减少，人工养殖发展迅速，但水科技有限公司产品；细菌基因组DNA提取试剂盒环境恶化及病害频发

4、给养殖业带来严重经济损失。和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，北京索莱宝科技腐皮病是黄喉拟水龟养殖过程中常见细菌性疾病之有限公司产品；受体菌DH5a由实验室保存；1kbLl]一DNAladder(大小依次为：10000、8000、6000、，慢性感染导致黄喉拟水龟体表溃疡、腐烂5000400030002500、2000、1500000、750、等[4]。关于黄喉拟水龟腐皮病的确切病因至今不500、250bp)、pMD18一T克隆载体，宝生物工程(大明，目前尚未见文献报道。连)有限公司产品。细菌通用引物F27：AGTTT—2013年3月，江苏省徐州市某养殖场饲养的黄GATCATGGCTCAG，R14

5、92：GTTACCTTGT—喉拟水龟发生腐皮病慢性感染，病龟临床症状主要TACGACTT，M13F：CAGGAAACAGCTAT—表现为，头、颈、肢部皮肤溃烂，蜕皮、爪脱落，有腥臭GACC，M13R：TGTAAAACGACGGCCAGT，由上味，严重感染导致死亡。本研究从黄喉拟水龟腐皮海生工生物工程技术服务有限公司合成。病灶进行细菌分离、生理生化试验、16SrDNA序列1．2方法比对并构建系统发育树，最终鉴定为类香味菌属新1．2．1病原茵分离纯化无菌生理盐水冲洗病龟种(Myroidessp．)，对类香味菌的分离鉴定、动物感体表病灶，无菌操作取病灶组织划线接种于LB培染和药敏试验等研究，以期为

6、黄喉拟水龟腐皮病的养基，29℃恒温培养24h。进一步挑取典型单菌落诊断与防治提供参考。分离纯化，获得纯种后进行革兰染色镜检，并接种于1材料与方法试管斜面4℃保存备用。1．1材料1．2．2菌株鉴定1．1．1试验用动物稚龟(平均体重8．0g，体长1．2．2．1形态学和生理生化鉴定无菌操作挑取收稿日期：2013—12—24作者简介：兰云(1987一)，女，江苏连云港人，硕士研究生，主要从事微生物及免疫学研究。胡秀彩(1976一)，女，江苏铜山人，实验师，主要从事微生物及免疫学研究。△同等贡献作者。*通讯作者130动物医学进展2014年第35卷第9期(总第255期)表2分离菌药敏试验结果Table2

7、Theantimicrobialsusceptibilityresultsoftheisolatedstrain注：S．表不高度敏感；I．表不中度敏感；R．表不咐药。Note：S．Denoteshighsensitivity；I．Denotesintermediatesensitivity；R．Denotesdrugresistance．为类香味菌可能通过污水传播。国内外关于水生类定及系统发育分析[J]．上海