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1、黄喉拟水龟腐皮病的确切病因探究 黄喉拟水龟(Mauremysmutica)又称石龟、石金钱龟、黄板龟、香龟等,隶属于龟科(Emydidae)、拟水龟属(Mauremys),具有较高食用、药用及观赏价值,已被列入《国家保护的有益的或者有重要经济、科学研究价值的陆生野生动物名录》.近年来,黄喉拟水龟野生资源日趋减少,人工养殖发展迅速,但水环境恶化及病害频发给养殖业带来严重经济损失. 腐皮病是黄喉拟水龟养殖过程中常见细菌性疾病之一[1-3],慢性感染导致黄喉拟水龟体表溃疡、腐烂等[4].关于黄喉拟水龟腐皮病的确切病因
2、至今不明,目前尚未见文献报道. 2013年3月,江苏省徐州市某养殖场饲养的黄喉拟水龟发生腐皮病慢性感染,病龟临床症状主要表现为,头、颈、肢部皮肤溃烂,蜕皮、爪脱落,有腥臭味,严重感染导致死亡.本研究从黄喉拟水龟腐皮病灶进行细菌分离、生理生化试验、16SrDNA序列比对并构建系统发育树,最终鉴定为类香味菌属新种(Myroidessp.),对类香味菌的分离鉴定、动物感染和药敏试验等研究,以期为黄喉拟水龟腐皮病的诊断与防治提供参考. 1材料与方法 1.1材料 1.1.1试验用动物稚龟(平均体重8.0g,体长4.0
3、cm)购自徐州市某花鸟市场,25℃饲养观察1周,确认健康无病后用于试验. 1.1.2主要试剂LB培养基、细菌生化鉴定管和药敏纸片,杭州微生物试剂有限公司产品;PCR反应试剂2TaqPCRMasterMix,南京诺唯赞生物科技有限公司产品;细菌基因组DNA提取试剂盒和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒,北京索莱宝科技有限公司产品;受体菌DH5α由实验室保存;1kbDNAladder(大小依次为:10000、8000、6000、5000、4000、3000、2500、2000、1500、1000、750、500、
4、250bp)、pMD18-T克隆载体,宝生物工程(大连)有限公司产品.细菌通用引物F27:AGTTT-GATCATGGCTCAG,R1492:GTTACCTTGT-TACGACTT,M13F:CAGGAAACAGCTAT-GACC,M13R:TGTAAAACGACGGCCAGT,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成. 1.2方法 1.2.1病原菌分离纯化无菌生理盐水冲洗病龟体表病灶,无菌操作取病灶组织划线接种于LB培养基,29℃恒温培养24h.进一步挑取典型单菌落分离纯化,获得纯种后进行革兰染色镜检,并接种于
5、试管斜面4℃保存备用. 1.2.2菌株鉴定 1.2.2.1形态学和生理生化鉴定无菌操作挑取适量分离菌接种于细菌生化鉴定管,29℃恒温培养48h,观察记录结果.参照《伯杰氏细菌鉴定手册》,对分离菌进行形态学和生理生化鉴定. 1.2.2.2分子鉴定参照胡秀彩等[6]方法进行,采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取分离菌基因组总DNA,10g/L琼脂糖凝胶电泳检测,置-20℃保存备用.以总DNA为模板,采用细菌通用引物进行16SrDNA基因PCR扩增,PCR体系为2TaqPCRMasterMix12.5μL,上、
6、下游引物各1μL,DNA模板1μL,ddH2O9.5μL,PCR反应条件为:94℃4min;94℃40s,55℃40s,72℃1min,35个循环;72℃延伸10min.PCR产物与pMDl8-T载体连接,转化大肠埃希菌DH5α,筛选阳性克隆,送上海生工生物工程技术服务有限公司测序.分离菌16SrDNA序列通过GenBank中的Blast进行相似序列检索,ClustalX1.83软件进行序列比对分析,采用MEGA4软件邻接法(Neighbor-joiningmethod)构建系统发育树
7、,并用Bootstrap对进化树进行1000次可信度分析. 1.2.3动物感染试验分离菌接种于LB液体培养基29℃培养12h,取0.5mL菌液倍比稀释,其余菌液于4℃保存,用倾注平板法测定菌液浓度,无菌生理盐水稀释至10CFU/mL.稚龟感染试验采用腹腔注射法,每组6只稚龟,感染组每只稚龟注射0.1mL菌液,对照组注射等量无菌生理盐水,连续观察14d,记录试验结果. 1.2.4药物敏感试验采用K-B法进行药敏试验,无菌操作将分离菌接种于LB平板,29℃培养24h,测量各药敏纸片抑菌圈直径,重复3次计算平均值.
8、 2结果 2.1分离菌形态及培养特征 从黄喉拟水龟腐皮病体表病灶处分离获得1株细菌,编号为TSM13032;分离菌在LB培养基上生长良好,菌落呈淡黄色、半透明、表面光滑、湿润、边缘整齐;革兰染色阴性,短杆菌,两端钝圆(图1) 2.2菌株鉴定 2.2.1生理生化鉴定 选用35项细菌生化编码鉴定管对分离菌进行生化特性检测,结果如表1所示,TSM130
