桑树青枯病病原菌的分离鉴定及其活体检测方法的建立

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1、学校代码：10289分类号：Q948.5密级：公开学号：122300004江苏科技大学硕士学位论文桑树青枯病病原菌的分离鉴定及其活体检测方法的建立研究生姓名曹梦琪导师姓名吴福安申请学位类别理学硕士学位授予单位江苏科技大学学科专业生物化学与分子生物学论文提交日期2015年04月27日研究方向植物病理学论文答辩日期2015年06月03日答辩委员会主席桂仲争评阅人盲审2015年06月06日分类号：Q948.5密级：公开学号：122300004理学硕士学位论文桑树青枯病病原菌的分离鉴定及其活体检测方法的建立学生姓名曹梦琪指导教师吴福安研究员江苏科技

2、大学二O一五年六月AThesisSubmittedinFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofScienceIsolation,IdentificationandEstablishmentofViableCellsDetectionofthePathogenofMulberryBacterialWiltSubmittedbyCaoMengqiSupervisedbyProfessorWuFuanJiangsuUniversityofScienceandTechnologyJune,

3、2015江苏科技大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：年月日江苏科技大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权江苏科技大学可以将本学位论文

4、的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于：(1)保密□，在年解密后适用本授权书。(2)不保密□。学位论文作者签名：指导教师签名：年月日年月日摘要摘要由青枯菌5号生理小种（Ralstoniasolanacearumrace5）引起的桑青枯病是我国一种毁灭性的作物病害。由于缺乏有效的防控措施，因此早期诊断、尽早防控是控制该病害爆发流行的重要手段。本研究通过对采自广东发病桑园病树根部组织的病原菌进行分离鉴定、致病性测试分离到一株致病力的青枯菌株RS-5。通过设计的青枯菌5号小种

5、特异性引物设计了荧光定量PCR方法，可有效检测青枯5号小种菌株。通过使用叠氮溴化丙锭（PMA）对菌株预处理，建立了青枯菌5号小种的活菌检测方法。从感染青枯病的桑树根部组织中分离到了3株具有典型青枯菌形态的桑青枯病病原菌RS-5，JX-3，GD-3，使用伤根接种法结合灌根接种法对三株菌进行致病性验证，其中RS-5可引发桑树产生青枯症状。对从发病桑苗中重新分离到的病原菌进行了培养形态观察和16SrDNA分子生物学鉴定，该菌与R.solanacearum的同源相似性高达99%，因而将此菌鉴定为青枯菌。通过青枯菌5号小种与其他小种青枯菌的差异片段，

6、筛选到了一对适宜的青枯5号小种特异性引物RS-72F/RS-312R，经过电泳验证和片段回收测序，验证该引物可特异性的扩增青枯菌5号小种DNA上241bp的特异性片段，而对于其他小种青枯菌和土壤中其他种属的微生物均没有扩增。普通PCR对青枯菌5号小种全基因组DNA的检测限为50pg/μL，对青枯菌5号小种菌液的检测限为41.0×10CFU/ml。以青枯菌5号小种全基因组DNA和青枯菌5号小种菌液为模-42板进行荧光定量PCR检测，在10~10ng/μL范围内，DNA浓度与Ct值呈现237良好的线性关系，线性方程为y=−2.747x+21.8

7、34(R=0.993)，在10~10CFU/mL范围内，菌液浓度与Ct值呈现良好的线性关系，线性方程为y=−3.418x2+45.447(R=0.998)。利用叠氮溴化丙锭（PMA）对细菌样本进行预处理，使用15ng/μL浓度的7PMA，暗孵育10min，强光曝光5min，可完全抑制10CFU/mL死菌中的DNA，37且不会对活菌DNA的扩增造成影响，在10~10CFU/mL范围内，PMA-qPCRI江苏科技大学理学硕士学位论文2的Ct值与菌浓的对数呈良好的线性关系，线性方程为y=-3.477x+47.489,R=0.997。该方法能从活死

8、菌混合体系中有效分辨出活菌。本研究首次建立了桑树青枯病病原菌青枯菌5号小种的活菌检测方法，为青枯病的早期检测和防控提供了一种新的技术支持，对于减少青枯病造成的损失和保障蚕桑行业可