鸡传染性支气管炎病毒广西分离株的致病性研究及实时荧光定量rt-pcr检测方法的建立

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1、鸡传染性支气管炎病毒广西分离株的致病性研究及实时荧光定量RT—PCR检测方法的建立摘要鸡传染性支气管炎(Infectiousbronchitis，IB)是由传染性支气管炎病毒(InfectiouSbronchitisvirus，IBV)引起的鸡的一种急性高度接触性呼吸道传染病，给养禽业带来了巨大的经济损失。IBV基因组十分容易发生变异，导致病毒的基因型、血清型、致病性、免疫原性等发生变异，给本病的防控带来很大的困难。近年来对IBV的分型研究很多，但对致病性没有做进一步的研究，更没有研究致病性和基因组变异之间的关系。结合IBV基因变异的情况，研究其在感染组织中的动态分布情况、消长规律和组织

2、亲嗜性变化，揭示IBV分子变异机理，是目前冠状病毒研究的热点。近年来第3群禽冠状病毒的宿主范围有扩大的趋势，除鸡、火鸡外，野鸽和家鸽等均可感染，但目前缺乏鸡源冠状病毒对鸽的致病性研究。目前检测IBV的方法众多，但存在无法定量的缺陷，病毒的定量检测对致病机理、免疫机理、防控效果的研究都具有重要意义。针对这些问题，本研究进行了IBV的致病性试验以及建立IBV的实时荧光定量RT-PCR检测方法。首先，在本课题组对26个广西IBv分离株进行基因分型将其分为4个基因型的基础上，从中选择代表4个不同基因型的9个广西IBv分离株进行人工感染雏鸡的试验。结果表明，4个基因型的广西流行毒株对非免疫雏I鸡均

3、具有致病能力，潜伏期为24h至48h，发病率88．8％至100％；基因型I(与H120亲缘关系很远)的GX．YL5、GX—C、GX．YL9、GX．NNl和GX。NN6能引起试验鸡死亡，死亡率可达11．1％．44．4％，并引起呼吸系统和泌尿系统的病变；试验鸡可带毒和通过泄殖腔排毒42天。而与H120亲缘关系很近或与4／9l亲缘关系很近的广西分离株未能引起试验鸡死亡。第二，应用本课题组建立的套式ImPcR对人工感染Gx．YL5分离株的雏鸡不同脏器中的病毒进行跟踪监测和组织病理学观察。结果表明肝脏和肺带毒19天，胸腺和腺胃带毒2l天，盲肠扁桃体和气管连续带毒26天，肾脏带毒长达40天，感染鸡带

4、毒和排毒持续时间可达42天；病毒能引起气管分泌粘液、气管和细支气管纤毛脱落、炎症细胞浸润，肺充血、淋巴细胞浸润，导致肾脏发生间质性肾炎以及法氏囊水肿。结果显示该毒株不但致病力强，排毒时间长，而且具有广泛的组织嗜性，能引起多个器官组织细胞结构发生变化。第三，选择对鸡致死率最高的分离株GX．YL5及与鸽源冠状病毒Sl基因高变区同源性很高的分离株GX．YL2对鸽子进行攻毒，结果显示GX．YL2和GX．YL5分别引起50％和25％鸽子出现呼吸道症状，并可以在鸽子体内进行增殖，带毒28天，但通过泄殖腔排毒不明显：鸽子感染IBV的解剖病变包括气管分泌粘液，肺出血，胰脏出现水肿及炎症，组织切片观察见到

5、胰腺中性粒细胞浸润、水肿，气管上皮细胞肿胀，肺出血等。整个实验过程未见到致鸽子死亡。表明了对鸡具有较强致病能力的鸡源IBV可以感染肉鸽，能在肉鸽体内不同组织中增殖，对肉鸽有一定的致病力，但对鸽子致病力不强。II第四，为了更好地研究IBV的病毒载荷量与致病机理、免疫机理、防控效果的关系，本课题建立了灵敏度高、特异性强、可重复性好的SYBRGreenI实时荧光定量RT-PCR检测方法，该方法最小可以准确检测到10拷贝／¨L的目的基因，常见禽类病毒NDV、IBDV、√6dW和ILTV均不能扩增。为本课题下一步的免疫原性试验提供很好的技术工具。综上所述，本课题研究结果表明，与H120亲缘关系很远

6、的广西IBV分离株对易感雏鸡有较强的致病能力，但对鸽子致病力比较弱；建立的实时荧光定量ImPCR检测方法快速、灵敏和特异。本研究结果为下一步的免疫原性试验提供物质和技术基础。关键词：传染性支气管炎病毒广西分离株致病性鸽子实时荧光定量RT-PCRUIPATHOGENICITYTESTOFDIFFERENTGENOTYPEGUANGXIINFECTIOUSBRONCHITISVⅡtUSESANDDEVELOPMENTOFAREAL—TIMEQUANTITATIVERr-PCRASSAYABSTRACTInfectiousbronchitis(IB)isahightlycontagiousre

7、spirator)rdiseasecausedbyinfectiousbronchitisVirus(IBV)，resultinginsignincanteconomicdama萨tothepoultr)，indust巧．Genotype，serot)，pe，pathogenicityandimmunogenici够VariationoccurduetotheVariationofIBVgenome，whichbringgreatd