鸡传染性贫血病毒感染宿主后的基因表达谱分析及实时荧光定量pcr检测方法的建立

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1、硕士学位（毕业）论文鸡传染性贫血病毒感染宿主后的基因表达谱分析及实时焚光定量PCR检测方法的建立学位申请人：杨丽聪指导教师：孙继国教授杨兵副研究员学科专业：预防兽医学学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二〇一五年五月二十四日独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其它人已经发表或撰写过的研究成果，也不仅含为获得河北农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名签子R

2、期：卞年i>月円学位论文版权使用授权书太学份论j作者完含了解河北农业大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权、河农业大学可以将学位元论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名:#而导师签名：签字日期：对文年幺月沭円签字日期：乂年文月％R学位论文作者毕业后去向：工作单位：电话：通讯地址：邮编:分类号:S851.34单位代码:10086密级:公开学号:2012361鸡传染性贫血病毒感染宿主后的基

3、因表达谱分析及实时荧光定量PCR检测方法的建立Establishmentofchickeninfectiousanemiavirusafterinfectionofhostgeneexpressionprofilingandreal-timePCRdetectionmethod学位申请人：杨丽聪指导教师：孙继国教授杨兵副研究员学科专业：预防兽医学学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二〇一五年五月二十四日1河北农业大学硕士学位（毕业）论文摘要鸡传染性贫血病毒（chickeninfectiousanemiavirus,CIAV）能够引起再生障碍性贫血以及胸腺和法氏囊

4、等淋巴组织的萎缩，已成为造成养鸡业巨大经济损失的重要原因之一。基因表达谱芯片属于基因芯片的一种，近年来得到了广泛应用，它能够用来检测宿主的基因组，研究病毒在不同状态下的基因表达情况。实时荧光定量PCR的原理是通过PCR产物的累积，使荧光信号强度等比例增加来实时监控扩增产物。本文研究了两部分，第一部分为鸡感染鸡传染性贫血病毒后的表达谱分析，第二部分为实时荧光定量PCR检测方法的建立。1.鸡感染鸡传染性贫血病毒后的表达谱分析由于鸡传染性贫血病毒的主要感染对象是雏鸡，并且能够通过水平传播和垂直传播，从而造成鸡只大量死亡。为了深入了解其致病机制，本实验首先通过CIAV感染1日龄SPF

5、雏鸡进行动物模型的建立，同时设立阴性对照，结果发现鸡只感染病毒后14日时发病最严重、症状最明显，于是采取14日龄鸡只胸腺，提取总RNA，反转录成cDNA，在体外合成cRNA，采用Affymetrix全基因组表达谱芯片与其杂交，从而得到基因表达谱的变化情况。利用SAM软件进行差异表达基因的筛选，同时将这些差异表达基因进行聚类分析，之后通过DAVID软件对我们得到的差异表达基因进行生物学功能分析，同时应用实时荧光定量PCR对基因表达谱芯片得到的结果进行验证。结果成功筛选出13708个差异表达基因，其中1759个上调基因，529个下调基因，其中与免疫相关的基因有38个，11420个

6、基因未发生变化。GO和Pathway分析结果显示，这些差异表达基因主要与免疫应答、细胞周期、细胞凋亡、血小板凝集等重要的信号通路有关。我们采用实时荧光定量PCR技术随机验证其中的7个差异表达基因，得到的结果与基因表达谱芯片的结果具有一致性，表明这次的芯片实验结果具有可靠性。2、实时荧光定量PCR检测方法的建立实时荧光定量PCR对样品检测准确、灵敏，并且能够准确定量，弥补了病毒分离鉴定、血清学诊断、PCR诊断方法、电镜检查以及测量血细胞压积值等检测方法的不足。实时荧光定量PCR包括探针法和染料法，由于SYBRGreenⅠ染料操作简单，成本低廉，因此得到广泛应用。本试验根据CIA

7、V基因组的保守区域设计了1对特异性引物，扩增后得到的片段大小为180bp，制备PGM-T-CIAV重组质粒，得到阳性质粒的标准品，绘制Q-RTPCR标准方程曲线，并做敏感性试验、特异性试验和重复性试验，最后对临床样品进行了检测。试验结果证实，在进行CIAV检测时，Q-RTPCR比普通PCR灵敏度要高、特异性要强、重复性要好，并且在对临床样品进行检验时，再一次证明其具有很高的灵敏度。关键词：鸡传染性贫血病毒；基因表达谱芯片；差异表达基因；荧光定量PCR；SYBRGreenⅠ2鸡传染性贫血病毒感染宿主后的基