家蚕核rDNA的克隆及其分子系统发育分析

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1、中文摘要本研究以家蚕为材料，使用SES、SDS、KI、CTAB法提取家蚕的基因组DNA，紫外和琼脂糖凝胶电泳表明：SES法提取家蚕丝腺DNA简便、快捷，提取的DNA质量较高。以其他昆虫的rDNA的保守序列为参考设计了多对特异引物，分段克隆并测序家蚕rDNA的全序列和柞蚕18SrDNA。测序结果拼接后表明家蚕18SrDNA为1907bp、ITSl为762bp、5．8S为167bp、ITS2为878bp、28SrDNA则长达3981bp，家蚕rDNA总长度为7695bp。将家蚕18SrDNA、柞蚕18SrDNA与从GenBa

2、nk中检索出的14个目18种昆虫的18SrDNA用Clustall．83软件进行多序列比对，表明昆虫的18SrDNA有四段相对保守序列，在同源区各物种昆虫之阳J碱基差别不是很大，变异主要由转换和巅换引起，而在多变区则主要由插入、缺失引起。用系统发育软件TPHYLIP3．63最大简约法和距离法以18SrDNA全序列及不同的同源区构建系统发育树，表明各种昆虫在分子系统发育树中的位置虽略有变化，但其关系基本一致：鳞翅目昆虫和双翅目昆虫首先在内部聚类后再相聚，两目昆虫之间的亲缘关系较近；等翅目与蜚蠊目关系较为接近；弹尾目、缨尾目

3、关系较接近，与其他昆虫的亲缘关系较远：膜翅目分类地位多变说明膜翅目的18SrDNA进化较快：通过对这些系统发育树的比较，为形态分类学存在争论的将半翅目和同翅目并为一系、捻翅目自成一系提供了分子水平的证据。用18SrDNA不同的同源区所构建的系统发育树大致相同，表明18SrDNA的不同同源区在进化上有协同进化的现象，且在5‘端和3’端则在进化上更为保守，同时结果表明18SrDNA是研究中等阶元以上的分子系统发育的有效标记分子。在ITSl序列内部存在明显的G、T结构：其中A占25．40％，T为30．30％：C为19．93％，

4、G为24．37％，在进化过程中有碱基选择的偏好性；而ITS2的A占28．35％，T为31．50％；C为18．11％，G为22．05％，A、T碱基明显较多。通过用Clustal1．83的自举NJ法构建的系统发育树表明，ITSl比ITS2在进化上相对保守，ITS2在进化过程中变异较大，ITSl适合于中等阶元的系统发育研究，而ITS2则可用于近缘种内的系统发育研究：28SrDNA最长，碱基组成基本均衡，没有偏异现象j通过对家蚕rDNA的克隆与序列分析，表明家蚕rDNA不同区段进化速率明显不同，为rDNA在家蚕起源与进化、品种选

5、育与鉴定等方顽的研究提供了一定的基础。关键词：家蚕核rDNA系统发育ABSTRACTSEQUENCEOFTHENUCLEARRIBOSOMALDNAOFTHESILKWORM，BOMBYXMORIANDTHEMOLECULARPHYI．，OGENYINFERREDFROMrDNASEQUENCEDaijunjunWeextractthegenomicDNAfromsilkworm，BombyxmoribythemethodsofSESSDS，CTAB，KI，theresultantDNAdeterminedbyUVand

6、argrosegelelectrophoresisindicatesthattheDNAcarl．bepreparedsimplyandrapidlybySESmethod．ThenwedesignseveralpairsofspecificprimersbasedontheanalysisoftheconservativesequencesofrDNAofotherorders．WecloneandsequencethecompleterDNAofthesilkworm，Bombyxmoriand18SrDNAofAn

7、theraeaperyiThecompletedsequenceoftherDNAiscomprisedof18SrDNA，ITS1，5．8SrDNAITS2and28SrDNAandtheirmolecularweightsareof1907，762，167，878and3981bprespectively，itsfullweiIghtis7695bp．Theweightofthe18SrDNAofAntheraeaperyiis1908bp．Themultisequencesof18SrDNAarealignedwi

8、ththoseofother18kindsofinsectsretrievedfromGenBankbytheClustal1．83software，thealignmentindicatesthat18SrDNAhasfourhighlyconservativeregions，Mostofvariationsinh