复式滋养层培养法构建组织工程化小鼠角膜上皮的实验研究

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1、中国医科大学学报第38卷第1期2OO9年1月JournalofChinaMedicalUniversityVo1．38No．1Jan．2009复式滋养层培养法构建组织工程化小鼠角膜上皮的实验研究马小力，孔琚，张劲松，刘汉强，赵江月(中国医科大学1．附属第一医院眼科，沈阳110001；2．附属第四医院眼科，沈阳110032)摘要：目的探讨构建组织工程化小鼠角膜上皮的理想方法。方法在Transwell气液界面培养系统中，利用复式滋养层培养法构建组织工程化小鼠角膜上皮，HE染色进行组织学观察，分别利用RTPCR、We

2、sternblot以及免疫荧光法检测上皮祖细胞标记p63、角蛋白19(K19)以及分化标记被膜素(involucrin)的表达。结果复式滋养层培养法构建可成功小鼠角膜上皮，上皮层数达5~7层。与RTPCR和Westernblot结果一致，免疫荧光结果显示上皮基底细胞层和基底细胞上层表达p63和K19，角膜上皮全层均表达involucrin。结论复式滋养层培养法可保持培养细胞的干细胞性质，是构建组织工程化小鼠角膜上皮的理想方法。关键词：小鼠；角膜；上皮；细胞培养；组织工程中图分类号：R318．021，Q73文献标

3、志码：A文章编号：0258—4646(2009)01—0028—03BioengineeredCornealEpithelialShetConstructedwithCompoundFeederCultureinMiceMAXiao—li’，KONGJun2,ZHANGJin—song2，LIUHan—qiang，ZHAOJiang·yue(1．DepartmentofOphthalmolo~v，TheFirstAfiliatedHospital，ChinaMedicalUniversity，Shenyang1

4、10001，China；2．DepartmentofOphthalmology，TheFourthAfiliatedHospital，ChinaMedicalUrfiversity，Shenyang110032，China)Abstract：ObjectiveToestablishanidealmethodtoconstructthebioengineeredcornealepithelialsheetinmice．MethodsUsingcorn-poundfeedercultureinTranswelcha

5、mbersystem，tissueengineeredcornealepitheliumwasconsU'ucted．Thecornealsheetswerestainedwithhematoxylinandeosin(HE)forhistologicalexamination．Theexpressionsofp63，keratin19(K19)，andinvolucrinweredeterminedbyim—mun0nuoresceneeassay，RT—PCR，andWesternblot．ResultsA

6、stratifiedepitheliumwith5to7layersofcellsWasconstructedbycon—poundfeederculture．Theimmunofluoreseentstainingshowedtheprogenitorcellmarkers，p63andKI9，wereexpres~dinthebasalandsuprabasallayersandinvolucrin，amarkerfordiferentiation，expressedinallthelayers，which

7、WasconsistentwiththeresultsofRT—PCRandWesternblot．ConclusionTheremarkablestratificationaswellasthelimbalphenotypemakethecompoundfeedersystemacandidatetoolforculturingtransplantableepithelialsheets．Keywords：mouse；comea；epithelium；cellculture；tissueengineering

8、角膜上皮细胞为可快速再生的复层扁平上皮，快表现出干细胞衰竭，使培养归于失败[4]。因此，在角膜上皮的稳态对于维持眼表的完整性以及正常的体外构建组织工程化角膜上皮的研究中，重建角膜视功能具有重要意义，而拥有强大增生潜力的上皮缘干细胞龛环境已经成为研究的焦点。本研究采用祖细胞(包括角膜缘上皮干细胞及瞬时扩增细胞)对Transwell气液界面培养系统、利用复式滋养层培养于维持角膜上皮的稳态起