组织工程化肌腱和腱鞘构建的实验研究

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1、上海第二医科大学博士学位论文组织工程化肌腱和腱鞘构建的实验研究姓名：曹德君申请学位级别：博士专业：外科学（整复外科）指导教师：曹谊林2003.4.1垡墼幽地燮虬堕CDNA疑r-PCRDEpCpBSECMd}疆挚D_蝤繁鼢涯EDl'ApGAD＆耐。E(强PIGF王潞S黼lt鬻AAbbreviationcompletedeoxyribonucleicacidReversetranscriptionalPCRDiethylpyroearbonatePhosphatebufferedsalineExtracellularmatrixD

2、eoxyribonucleosidetirphosphateDiaminobe菇zidineTransmissionelectronmicroscopeEthyleneDiamine-TetraacidicAeidPolyglycolieacidsDulbeco’sModifiedEagle'sMediumEnhancedgreenfluorescentproteinInsulinGrowthfactorFetusBovineSerumMessageRNA上海第二二医科大学博士研究生毕业论文组织工程诧腿腱巍腱鞲稳建的实验研究中

3、文摘簧肌腱缺损是临床常见疾瘸之一，轻者会引起肢体功能障碍，重者引起肢体残疲。最翦零用的治疗方法主要楚囊体、黪终瓢慰移植或袋爆生物誊毒辩来修复肌腱缺损。自体肌腱来源有限且造成供联损伤，异体肌腱或生物材料则零导致免疫撵斥反反竣感染。霞嚣霆琏腱静蒺伤逢豢箨富蕤赣霓其霆涝貘鞲弱损伤，近年泉认识到完整的腱鞘尤其保持完熬的滑膜鞘对于肌腱的修复和肪止虢糙与髑阑组绥静粘连有徽重要静作爝。缀织工程技术将疑未来稿床医学由替代向重建发展的霪要手段，也有效地解次了替代组织缺麓的问磁。肌腱的组织工程化构建已经取得了一定的成果，然而种予细胞的来源始终困扰

4、着人们，腱鞘的组织工稷学研究也尚未褥到野震。临廉上用予移接替代缺攫腿腱的缀织必须具有一定的抗摭力。截趸目前，大多数组织工糨化肌麟的构建帮是拄动物髂巍透露，梅建勰麓雾誊蘩藤与秘辩豹复合凌撬拉力骞覆，不稳予肌腱的形成，并且容易形成肌腱粘连，同时对肌腱形成过程的动态研究以及组织工程话魏腱静产驻纯遣势必将在蒋多}避行。本潆惩结合缀绞工稔学静最新技术，结合以往的研究成果，寻找一神修复肌腱和腱鞘损伤的有效方法。[方法]1)俸外培养人矾腱细胞和入皮黻成纤维缅胞，观察细胞的形态特点及超微结枣每；了解两秽缨胞的生长曲线变化；用免疫组他蛉方法比较

5、两种细胞的胶原分泌情况；抽撼细胞的mRNA，采用RT-PCR梭测II型前胶原基嚣豹表达势以t3--aetin先蠹参照，扶分子零孚宪较嚣秘缨戆多浚蕊钱居腔原分泌能力的变化：用WesternBlotting的方法，从蛋白水平比较各代次皮肤成绎缭壤晁襄飘涟蘩熬胶暴分澄弱绪凝。2)收集人成纤维细胞和人肌腱细胞，以20x106个细胞密度散点接种于条索狄PGA上，体井培养1w后圃植入裸鼠皮下，并予回植詹3w、6w取材，进幸亍缀织学检测。4上海第二医科大学饕圭霹}究囊毕监论文⑧3)将EGFP转染人成纤维细胞后接种于PGA上，体外培养1w后回

6、植天撩聚皮下，3w纛激褪进行荧光羧溺。4)将取自Leghorn鸡的肌腱宴田胞体外扩增培捧后以20x106个细胞密度敖点接种子条索袄PGA上，1w焉分维：实验壅(舻5)；麓U形弹簧给缀耱．PGA复合物持续张力并在体外继续培养；对照组l(n-4)：肌腱细胞--PGA复合物在天张力下继续体外培养：对照组2(n_3)用U形弹簧给荦纯PGA持续张力著在#外培养。分别于2、4、6周作组织学和I裂胶原受疫组化梭测。对6周标本作透射电镜检测，同时测定新生组织的抗拉力，比较在体外组织工程他萎琏蕤稳建中努力瓣擒建瓢毽强度熬影嚷。5)将取自Legh

7、orn鸡的滑膜鞘细胞体外培养进行鉴定；滑膜细胞体外扩增螽释植予片获PGA纾缭上，俸乡}培养1w螽卷藏管菝，内村硅荻譬，圄穰裸鼠皮下，并于回植后3w、6w取材，进彳亍组织学检测，嗣时以未加滑膜绷胞的单纯PGA作为对照；同时将纲艟一P姒复合物体井培养1w最修复自体鸡的腱鞘缺损，回掇后3w取材进符组织学检测。[结果]1)随着传代次数增多肌腱细胞比成纤维细胞更容易老化；两种细魏赌徒至繁3戡粒麴生长藏线走行趋势趣避，薅繁6钱醛腿艇缨爨戆增殪较缓慢；免疫组化检测肌腱细胞主要分泌I型胶原，而成纤维细胞同时分泌I、疆熬莪覆：应露RT-PCR方

8、法嚣定维魏鹣l鳌蘸获琢基因袭达清滋，发褒羹琏腱细胞随传代次数增加，I型前胶原基因袭达逐渐减弱而成纤维细胞基本保持稳定；WesternBlotting法也发现成纤维缁脆醚着传代次数增蕊，l登胶漂分泌变化不明显，瓶肌腱细胞随传代次数增加胶原分泌降低。2)在裸鼠皮下可形成肌腱样缎织