原位的构建工程化肝组织实验地地研究

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1、军医进修学院硕士学位论文原位构建工程化肝组织的实验研究中文摘要研究背景：我国是肝病高发区，大量终末期肝硬化患者消耗着巨额医疗费用却没有治疗前途。对于终末期肝硬化所致肝功衰竭，肝移植是可供救治的有效甚至是唯一手段。当前供肝的严重不足已成为开展这一治疗的主要障碍。人们一直在寻找治疗肝硬化的新途径。组织工程技术的快速发展为构建可植入性肝组织，实现肝脏功能的部分替代提供了可能．研究目的：建立一种简便安全的原位构建工程化肝组织的方法，并评价其改善肝硬化大鼠肝功能的效果。方法：1)以胰酶消化法从新生大鼠肝脏分离肝细胞并进行体外培养

2、，倒置显微镜动态观察细胞形态，四唑盐(MTT)比色法评价细胞的增殖活性，用免疫荧光法检测肝细胞白蛋白。用PAS(Periodicacid-Schiff，PAS)染色检测糖元。2)将肝细胞与胶原复合构建细胞／凝胶复合物，进行立体培养。采用相差显微镜、扫描电镜、MTT比色法、H．E．染色和免疫组化染色分别对工程化组织的生长情况及组织形态特征进行观察，并测定其白蛋白合成能力及尿素的代谢水平。3)新鲜分离的肝细胞，以PKH26标记后与液态胶原复合，以注射法植入正常大鼠肝脏．于第0、3、7天序贯取样，切片，分别进行荧光示踪观察，

3、HE染色和白蛋白免疫组化染色对“类肝组织”进行形态学观察。4)将新生大鼠肝细胞／胶原凝胶复合物，以多点注射法植入肝硬化大鼠肝脏，而空白对照组仅移植胶原。在移植后第7、28天取样对受体肝脏进行形态学观察，包括H-E．染色及白蛋白免疫组化染色。并在第3、7．14、21、28天取静脉血，测定血清白蛋白、球蛋白及总蛋白含量。结果：1)以胰酶消化法分离获得新生大鼠肝细胞约为1．5X106／鼠肝，活性95％vX上。在培养过程中肝细胞维持正常形态，呈集落生长，7d时长满孔底，此后直至第19d基本无变化。MTT值在培养11d升至峰值，

4、随后逐渐下降。新生肝细胞白蛋白染色及PAS糖原染色均阳性。2)肝细胞与胶原凝胶复合后，细胞均匀分布在复合物中，培养过程中保持稳定的细胞形态。扫描军医进修学院硕士学位论文电镜示肝细胞形态正常，相互粘附。MTT检测显示肝细胞活性直至第5天时仍然保持75％的细胞活性，之后快速下降。体外培养5天后，可见肝细胞在胶原凝胶中呈立体生长，并保持其特异形态。免疫组化证实这些肝细胞抗白蛋白抗体染色呈强阳性。对培养上清中白蛋白和尿素的含量测定表明，肝细胞在胶原凝胶中可保持稳定的代谢合成功能达5天．3)肝细胞／胶原复合物能简便地植入到受体大

5、鼠肝脏；荧光显微镜观察到移植区域主要由PKH26阳性细胞组成；H．E．染色可见移植区域肝细胞在胶原材料中成簇生长；免疫组化染色证实植入肝细胞表达白蛋白。4)在肝硬化大鼠模型，H．E．染色显示多点植入的肝细胞凝胶复合物与受体大鼠肝组织整合，在原位形成新生“类肝组织”；新生肝细胞形态良好，并相互连接成片．免疫组化染色显示其表达白蛋白．移植组肝硬化大鼠血清白蛋白浓度随着观察时间的延长逐渐升高，而对照组则逐渐降低，在第21天移植组开始高于对照组。而移植组和对照组的A／G几乎没有差异。结论：1)新生大鼠肝细胞可以通过胰酶消化法简

6、便、高效的获得，在体外培养条件下具有较高的增殖活性及分化能力，可以作为种子细胞应用于肝组织工程研究。2)新生大鼠肝细胞与胶原复合可在体外构建出具有一定活性及功能的工程化肝组织前体。3)这种肝细胞／胶原复合物可通过原位注射方便安全的植入到正常大鼠肝脏，并能在原位形成具有一定功能的工程化肝组织。4)在肝硬化大鼠肝脏原位构建的类肝组织与宿主肝脏整合良好，并能改善机体肝功能，这种方法具有潜在的·临床应用前景。关键词：肝组织工程，新生大鼠，肝细胞，胶原，可注射，肝硬化，原位，移植2军医进修学院硕上学位论文Experimental

7、StudyonConstructioninSituofEngineeredLiverTissueABSTRACTAIM：Todevelopanovelmethodofconstructioninsituofengineeredlivertissue，andevaluateitstherapeuticvalueonratswithdecompensatedcirrhosis．METHODS：OTheliversofneonatalratsweredigestedbytrypsintoisolatehepatocytes．

8、Thehepatocyteswereseededontoplasticculturedishesandculturedinvitro．PhasecontrastmicroscopyWasusedtOobservethemorphologyofthehepatoeytes．Cellproliferationwasestimatedu