人骨髓来源干细胞体外的构建组织工程血管实验地地研究

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1、...上海交通大学硕士毕业论文AbbreviationEPCsEndothelialProgenitorCellsECsEndothelialCellsPBSPhosphateBufferSalinehBMSCshumanBoneMarrowStemCellsDMEMDelbecco’sModifiedEagleMediumFBSFetalBovineSeriumRT-PCRReversetranscriptionalpolymerasechainreactionDEPCDiethylpyrocarbonate

2、dNTPDeoxyribonucleosideTirphosphateDABDiaminobenzidineEDTAEthyleneDiamine-TetraacidicAcidPGAPolyglycolicacidsVSMCsVascularSmoothMusclecellsSMɑ-actinSmoothMuscleɑ-actinSMMHCSmoothMuscleMyosinHeavyChainSMcalponinSmoothMusclecalponinSM22ɑSmoothMuscle22ɑPDGF-BBP

3、lateletDerivedGrowthFactor-BBRNaseRibonuclease12......上海交通大学硕士毕业论文SEMScanningElectronMicroscopyBSABovineserumalbuminEBEthriumBromideEGMEndothelialGrowthMediumFACSFluorescentactivatedcellsortingFITCFluoresceinIsothiocynateH.EHaemaoxylin-eosin13......上海交通大学硕士毕

4、业论文人骨髓来源干细胞体外构建组织工程血管实验研究摘要目的：1．研究人骨髓来源的内皮祖细胞向内皮细胞诱导分化的可行性。2．研究人骨髓间充质干细胞在体外诱导为血管平滑肌细胞的可行性。3．研究由人骨髓基质干细胞来源的血管平滑肌细胞复合PGA材料支架，在血管生物反应器搏动环境下构建组织工程小口径血管的可行性。方法：1.人骨髓来源的内皮祖细胞向内皮细胞诱导分化的实验研究：抽取健康成人志愿者骨髓5ml，经密度梯度离心分离得单个核细胞。将单个核细胞贴壁培养于纤维粘连蛋白（fibronectin，FN）包被的培养皿中，12小

5、时后更换培养液，低血清（2％）DMEM-LG培养液中培养。细胞60％融合后消化传代。传代前，FACS分析原代细胞内皮祖细胞（EPCs）标志CD133、CD34、Flk-1表达情况。第一代细胞用于诱导分化实验，分诱导组和对照组。诱导组采用EGM-2(含2%FBS)培养液诱导培养，对照组仍用DMEM-LG（含有10％FBS）培养液培养。诱导至14天[MS1]，倒1......上海交通大学硕士毕业论文置相差显微镜下观察细胞形态改变；免疫荧光、RT-PCR检测内皮细胞标记CD31、VEcadherin、Flk-1表达情

6、况；FACS分析细胞诱导阳性率；细胞摄取DiI-ac-LDL的实验检测内皮细胞功能。2．人骨髓间充质干细胞向血管平滑肌细胞诱导分化的实验研究：抽取健康成人志愿者骨髓5ml，经密度梯度离心分离得单个核细胞，DMEM-LG（含10％FBS）培养液中培养。60％融合后传代，第一代细胞用于实验。实验PDGF-BB(Plateletderivedgrowthfactor-BB,PDGF-BB）诱导组与无PDGF-BB组（对照组）两组。诱导组培养液为添加诱导因子PDGF-BB（20ng/ml）的EGM-2培养液，对照组培养

7、液为EGM-2培养液。诱导14天，倒置相差显微镜下观察诱导细胞形态学的改变；免疫荧光、RT-PCR、Western-Blot方法检测血管平滑肌细胞特异标志（SMɑ-actin、SMMHC、SMcalponin和SM22ɑ）的表达情况；FACS检测细胞诱导阳性率。3．HBMSCs来源的VSMCs复合PGA支架，在搏动环境下体外构建小口径血管的实验：HBMSCs诱导得的VSMCs以50×106/ml的浓度接种于无纺PGA纤维支架，培养于添加PDGF-BB（20ng/ml）的DMEM-LG（含10％FBS）培养液中。

8、培养两周后，将细胞材料复合物移至血管生物反应器内继续培养，培养液成分如前。分搏动组和静态组。搏动组处于搏动环境下，搏动频率由低频（60次/min）到高频（165次/min），管道流量由低流量（250ml/min）到高流量（450ml/min）递增，每日工2......上海交通大学硕士毕业论文作12小时，静态组无搏动刺激。培养6周后取材，大体观察构建血管的形态、颜色、弹性。扫描电镜（SE