人骨髓基质干细胞体外构建组织工程心脏瓣膜实验的研究

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1、第一军医大学颂士学位论文摘要胸心外科专业摘要目的：组织工程心脏瓣膜作为一种理想的具有活性的人造心脏瓣膜，已成为目前心脏瓣膜外科研究的热点。它是将种子细胞种植在三维结构的支架上，通过适当方法培养成成熟或半成熟的瓣膜组织，然后植入体内，最终逐渐形成有活性的瓣膜组织，发挥正常瓣膜的功能，它的研制具有广阔的临床应用前景。种子细胞是开展组织工程心脏瓣膜研究的重点。人骨髓基质干细胞(MSCs)因具有多向分化潜能、临床上易获取、创伤小等优点，理论上讲，应该是组织工程心脏瓣膜比较理想的种子细胞。本实验的目的是将体外培养扩增的人骨髓MS

2、Cs种植在去细胞猪主动脉瓣叶上，观察细胞生长情况，以探讨人骨髓MSCs体外构建组织工程心脏瓣膜的可行性。方法：1．去细胞猪主动脉瓣叶支架的制备采用l％Triton-X100、O．01％胰酶．0．02％EDTA、DNaseI及RNaseI对猪主动脉瓣叶进行去细胞处理：Instron力学测定仪对去细胞瓣叶和新鲜瓣叶进行生物力学测定，测定瓣叶的断裂强度、断裂伸长率，结果以X4-S表示，采用t检验对数据进行统计学分析；去细胞瓣叶行常规H．E染色和扫描、透射电镜检查，观察组织结构。2．骨髓MSCs的体外分离、培养、扩增和鉴定胸骨

3、穿刺获取骨髓抽吸液，用Ficoll液分离离心，取界面层细胞在含20％胎牛血清DMEM液中培养，贴壁细胞即得到MSCs。光镜观察培养细胞形态；流式细胞仪检测MSCs对CD34(造血干细胞的表面标志)、CDlla(淋巴细胞表面标志)、CD29(整合素家族的成员)抗原的表达；培养扩增的MSCs行a-SMA免疫组化染色及免疫印迹分析检测细胞内I型胶原蛋白的表达。3．组织工程心脏瓣膜构建中细胞种植的实验研究将培养扩增的骨髓MSCs种植在去细胞猪主动脉瓣叶支架上，静态培养7天，行常规H—E染色、Ⅱ．SMA免疫组化染色及扫描、透射电

4、镜检查，观察细胞生长情况。2第一军医大学硕士学位论文摘要胸心外科专业结果：1．瓣叶去细胞前、后的断裂强度(642+125)g／mm2VS(636+130)eJmm2，P>O．05和断裂伸长率(54士12)％vs(57土13)％，P>0．05，两者均无明显差别。去细胞瓣叶组织中的细胞能完全去除，胶原纤维波浪状结构无明显损伤。2．骨髓MSCs对CD34和CDIla表达阴性，CD29表达强阳性。传代扩增培养的MSCs细胞呈均一梭形，n．SMA免疫组化染色阳性，免疫印迹分析检测细胞内有I型胶原蛋白的表达。3．常规H—E染色显示

5、种植细胞在去细胞瓣叶支架上紧贴瓣叶表面生长，形成一基本连续的细胞层，但未见细胞向瓣叶基质内部长入。a．SMA免疫组化染色阳性，扫描电镜观察瓣叶表面细胞不规则生长，透射电镜可观察到细胞内存在肌动蛋白肌丝的结构。结论：1采用1％Triton—X100、0．01％胰酶一0．02％EDTA、DNaseI及RNaseI去细胞方法，可以完全去除猪主动脉瓣叶的细胞，对其生物力学性能无明显影响。去除细胞成分的猪主动脉瓣组织是一种良好的纤维支架，可以用于构建组织工程心脏瓣膜。2．骨髓MSCs在20％胎牛血清DMEM培养液培养下能分化成肌

6、成纤维细胞。3．体外培养扩增的骨髓MSCs能在猪去细胞瓣叶上生长，显示较好的生物相容性，作为种子细胞构建组织工程心脏瓣膜是可行的。关键词组织工程心脏瓣膜人骨髓基质干细胞猪主动脉瓣去细胞细胞种植第二军医大学硕士学位论文英文摘要胸心外科专业ABSTRACTobjective：Tissueengineeringheartvalve，asallideallivingheartvalveprostheses，hasnowbecomeafocusofstudyinthefieldofheartvalvesurgery．Thedef

7、initionoftissueengineeringvalveistouseappropriatecells，deliverthosecellsontoa3-Dsupportingscaffold，cultureintomatureorsub—maturetissueandtransplantthemintobodies，ultimatelyformthenewfunctionaltissuewiththeabilitytogrowandremodel，whichwouldbeamajorimprovementonth

8、ecurrenttreatmentofheartvalvedisease．Establishingareliablecellsourceisakeytoeffectivetissueregeneration．AshumanMSCsexhibitthepotentialtodifferentiateintomultipleceil'