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1、研究人骨髓基质干细胞构建组织工程心脏瓣膜-->[摘要] 取心血管外科手术患者胸骨骨髓,Ficoll离心法获取单个核细胞,体外培养扩增后种植在猪去细胞主动脉瓣叶表面2周,观察细胞生长情况;免疫组化检测细胞分化结果;扫描电镜和透射电镜观察细胞种植情况。结果经体外培养的人骨髓基质干细胞在去细胞猪主动脉瓣叶纤维网状支架表面形成一层基本连续的细胞层。认为去细胞猪主动脉瓣叶组织是良好的纤维支架,可用于构建组织工程心脏瓣膜;人骨髓基质干细胞种植在去细胞猪主动脉瓣叶上构建组织工程心脏瓣膜是可行的。[关键词] 组织工程;心脏瓣膜;骨髓基质干细胞
2、组织工程心脏瓣膜是一种新型人造瓣膜。人骨髓基质干细胞(MSCs)具有多向分化潜能、临床上易获取、创伤小等优点,是构建组织工程心脏瓣膜理想的种子细胞。2006年以来,我们将人骨髓MSCs种植在去细胞猪主动脉瓣叶上,进行体外构建初级组织工程心脏瓣膜。1 材料与方法1.1 骨髓MSCs的体外分离和培养 取心脏手术患者的正常骨髓,开胸前于胸骨柄处抽取,每次约5ml。骨髓MSCs的分离和培养参照文献[1]。细胞长至80%~90%融合时用0·05%胰蛋白酶消化传代,按5·0×103个/cm2接种于传代培养瓶中进行扩增培养,取第3代细胞用于细胞
3、种植。1.2 去细胞猪主动脉瓣叶纤维网状支架的制备 新鲜猪主动脉置于含1%TritonX-100、0·01%胰酶、0·02%EDTA的磷酸盐缓冲液50ml中,再加入DNaseⅠ及RNaseⅠ,恒温摇床内37℃消化24h,PBS冲洗备用。1.3 细胞种植 种植前将去细胞主动脉瓣叶用γ射线照射2h灭菌;然后将去细胞瓣叶置于含PBS的烧杯中浸泡12h,以增加细胞和支架之间的黏附力,取出移入无菌12孔培养板中,将对数生长期细胞经胰酶消化后制成5×106个/ml的细胞悬液,每个瓣叶接种100μl细胞悬液,加入含20%PBS、100U/ml青
4、霉素—链霉素的DMEM培养液1m,l37℃、5%CO2、饱和湿度孵箱内培养24h。重复种植2次,继续培养4d,共7d。第7天取瓣叶固定,常规HE染色、α-SMA免疫组织化学染色和电镜观察,扫描电镜和透射电镜观察细胞种植在瓣叶表面的生长状况。2 结果2.1 人骨髓MSCs形态学特点和表面抗原特性 MSCs细胞体积较小,核/质比例大,染色质较疏松,核仁明显,胞质内细胞器不发达,表现出干细胞的特点。流式细胞仪检测CD29强阳性,CD34(造血干细胞表面标志)和CD11a(淋巴细胞表面标志)阴性,表明MSCs是骨髓中区别于造血干细胞的一群
5、处于未分化状态的非定向干细胞。2.2 去细胞瓣叶组织学特点 光镜下观察,主动脉内膜面及瓣下心内膜的内皮细胞去除完全,未见残留的间质细胞和心肌细胞。VB染色结果显示,弹力纤维及胶原纤维结构保留完好。扫描电镜显示,去细胞瓣叶表面胶原纤维束排列完整,保存良好,无溶解及断裂,瓣叶表面无内皮细胞附着。2.3 组织工程瓣膜的组织学特征 HE染色可见瓣膜表面有一层细胞覆盖,切片免疫组化Vimentin和α-SMA染色阳性。扫描电镜显示瓣膜表面有一层密集细胞层覆盖,细胞大多呈圆形或梭形,排列规整,透过细胞间隙可见到深部去细胞支架,瓣叶表面覆盖细胞
6、,无明显的排列顺序。透射电镜显示瓣膜表面有活性细胞层覆盖,细胞胞质内可见大量内分泌颗粒和细胞器,细胞内可见肌动蛋白肌丝结构。3 讨论心血管瓣膜组织工程的种子细胞须满足以下特点:①容易培养,生长力旺盛,黏附力强;②具有正常细胞相似的生理功能;③取材容易,无创伤或微创伤。心血管和瓣膜组织工程的复杂之处在于其参与构建需两种细胞,即内皮细胞和间质细胞,且外部生理、力学环境非常苛刻。传统的种植细胞方法是先种植成纤维细胞,再种植内皮细胞。但由于内皮细胞和成纤维细胞均生长缓慢且接种后容易衰老,影响了组织工程瓣膜的远期实验效果,而且需要损伤一段血
7、管,故达不到组织工程种子细胞的要求。骨髓MSCs具有贴壁生长的培养特点,具有多分化的潜能,可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞等多种间充质细胞,而且取材方便,非常适于作为细胞移植工程的种子细胞[2,3]。本实验采用猪主动脉瓣叶制备胶原纤维网状支架,由于去除了异种瓣膜的细胞成分,明显减少了异体细胞引起的免疫反应造成的瓣膜钙化和衰败,同时保留了瓣膜原有的胶原纤维和弹力纤维,为种植细胞的黏附提供了一个结构和生理性的环境,便于细胞黏附、生长。实验结果显示,MSCs是骨髓中区别于造血干细胞的一群处于未分化状态的非定向干细胞,第2、
8、3代体外培养的MSCs具有肌成纤维细胞的特性,如表达α-SMA。免疫印迹分析细胞内有Ⅰ型胶原蛋白表达,表明MSCs在含20%PBS的DMEM培养液中能分化成为肌成纤维细胞。肌成纤维细胞具有合成和分泌细胞外基质的功能,对瓣膜重塑起重要作用。种植细胞在
