构建具有神经支配的工程化心肌组织的初步研究

《构建具有神经支配的工程化心肌组织的初步研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、构建具有神经支配的工程化心肌组织的初步研究：王静，郭立国，冯金升，任红茹【摘要】探索神经生长因子诱导的交感神经元样PC12细胞作为组织工程化心肌组织神经支配研究模型的可行性。用含0.04%EDTA的0.25%胰酶分离新生大鼠原代心肌细胞,然后与NGF诱导的交感神经元样PC12细胞在液态的Ι型胶原中共培养，通过光学显微镜观察、常规H.E.染色、免疫组织化学染色和透射电镜观察等对其进行评价。在三维共培养模型中，NGF诱导的交感神经元样PC12细胞长出神经突起，突起及其上的膨体能够到达跳动的心肌细胞表面，神经突起随心肌细胞

2、一起跳动。说明采用神经元样PC12细胞作为组织工程化心肌神经支配的模型是可行的，神经细胞与心肌细胞可能有支配关系。【关键词】组织工程；心肌细胞；PC12细胞；共培养；神经支配；神经生长因子Abstract：ToinvestigatethepossibilityofneuronalPC12cellsbeingusedasmodelstoinvestigatetheinnervationoftissue-engineeredcardiactissue.Neonatalratprimarycardiacmyocytesis

3、olatedpatheticneuron-likePC12cellsinliquidtypeIcollagenliquid.Afterthat,H.E.staining,immunhistochemistrystainingandtransmissionelectronmicroscopyodel,NGFinducedPC12cellsoutgreyocytesandmovedalongyocytes.Theirvaricositiesalsotouchedyocytes.Theresultsofourstudysu

4、ggestthatPC12cellsisafeasiblemodeltobeusedinthestudyofneuralinnervationoftissueengineeredcardiactissue.Andthecardiomyocytesmaybeinnervatedinthismodel.Keyyocytes；PC12;；Co-culture；Innervation；Nervegroa),胎牛血清(北京元亨圣马生物技术研究所),胰酶(Sigma),基质蛋白(Matrigel,Sigma),cTnT抗体(武汉

5、博士德公司,1∶500)，生物素标记的羊抗小鼠试剂盒(中山试剂公司),DAB显色试剂盒(中山试剂公司)，NGF（神经生长因子）等。2．2方法2.2.1心肌细胞的分离［8］取新生大鼠心室肌组织，充分剪碎后用0.25％的胰酶消化的方法获得单细胞悬液，在含有15%胎牛血清的DMEM培养液中差速贴壁1h取上清离心，以去除成纤维细胞。收集未贴壁细胞，其中主要为心肌细胞。2.2.2PC12细胞的培养PC12细胞按常规复苏，以5×105/ml的浓度接种于25ml培养瓶中，培养液为PC12细胞生长培养基，置于37℃孵箱内培养。24h

6、后加入NGF，浓度为50ng/ml,隔天换液一次。2.2.3Ⅰ型胶原的制备［9］从大鼠尾根部切断鼠尾，置于75%的酒精中浸泡30min，无菌条件下撕下尾腱，剪碎。取尾腱碎片浸入于0.1%的醋酸中，置4℃冰箱，并用磁力搅拌器进行搅拌。48h后离心收集上清即得胶原溶液。制备的胶原溶液中所含的胶原浓度约为3.0mg/ml。2.2.4PC12细胞与大鼠心肌细胞在液态胶原中的混合培养液态Ⅰ型胶原(3.0mg/ml)与2×DMEM（添加20％胎牛血清，）等比例混合，用0.1mol/LNaOH调为中性，再加入占上述混合液体积总量1

7、0％的Matrigel。将分离的新生大鼠心肌细胞（浓度为3×106/ml）与PC12细胞（浓度为3×104/ml）与上述混合物混合，加入12孔板中，置5%CO2、37℃培养箱中，心肌细胞/PC12细胞／胶原混合液即可在槽中凝固成片状的心肌细胞/PC12细胞／胶原复合物。60min后加入培养液及NGF50ng/ml。3结果3.1相差显微镜下观察的结果相差显微镜下观察，第二天即可见单个的神经细胞长出突起，随着时间的延长，长出突起的细胞越来越多，突起也越来越长，在心肌细胞的表面延伸（见图1A）。心肌细胞在培养的第二天即可见

8、单个细胞在跳动，第三天即可见一簇一簇的细胞在跳动，第五天神经细胞生长的神经突起呈放射状到达心肌细胞的表面并随心肌细胞一起跳动（见图1B）。图1PC12与心肌细胞在液态胶原中混合培养的相差显微镜下观察的结果A.神经细胞长出的神经突起（↑）分别到达心肌细胞（▲）的表面(×40)B.神经细胞长出的神经突起（↑）呈放射状到达心肌细胞的表面并随心肌细胞一