组织工程化神经的体外构建及其修复大鼠坐骨神经缺损的研究

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1、博士学位论文论文题目组织工程化神经的体外构建及其修复大鼠坐骨神经缺损的研究研究生姓名汤欣指导教师姓名顾晓松专业名称人体解剖与组织胚胎学研究方向组织工程与神经再生论文提交日期2013年5月组织工程化神经的体外构建及其修复大鼠坐骨神经缺损的研究中文摘要组织工程化神经的体外构建及其修复大鼠坐骨神经缺损的研究中文摘要第一部分组织工程化神经的体外构建目的采用背根神经节（DRG）神经元、施万细胞与生物材料支架在体外共培养，构建成一种类似神经组织的组织工程化神经，从而为更好地模拟自体神经移植修复神经缺损提供新技术。方法1.取新生1dSD大鼠坐骨神经，通过反复植块法获取高纯

2、度的施万细胞；2.施万细胞注入丝素蛋白神经移植物管腔内，于生物反应器中培养7d后，两端各植入胚胎14.5-16.5dSD大鼠L4-6DRGs；3.培养基中培养，建立施万细胞/背根神经节(DRG)共培养体系，体外构建组织工程化神经；4.免疫细胞化学染色观察施万细胞、DRG与丝素蛋白神经移植物共培养2w的情况；5.扫描电镜分别于共培养2w、3w和4w后，观察丝管内细胞生长情况；6.透射电镜观察共培养3w后，丝管内超微结构和髓鞘形成情况。结果1.建立了施万细胞/背根神经节(DRG)/丝素蛋白神经移植物共培养体系，体外成功构建组织工程化神经；2.免疫细胞化学染色观察

3、施万细胞、DRG与丝素蛋白神经移植物共培养2w后，S100阳性施万细胞与NF阳性DRG神经突起沿着丝素纤维，呈条带状纵向平行生长；3.扫描电镜观察结果表明，施万细胞与DRG神经突起呈纵向平行生长，共培养4w后有类似基质样结构形成；I中文摘要组织工程化神经的体外构建及其修复大鼠坐骨神经缺损的研究4.透射电镜结果显示，施万细胞、DRG与丝素蛋白神经移植物共培养3w后，有髓鞘的形成。结论采用施万细胞、DRG与丝素蛋白神经移植物体外联合培养，可构建成具有神经样结构的组织工程化神经。第二部分组织工程化神经修复大鼠坐骨神经缺损的研究目的采用形态学、生物化学和电生理学等方

4、法，检测组织工程化神经修复大鼠坐骨神经缺损的功能效果，为进一步完善组织工程化神经的构建提供参考。方法1.将体外构建的组织工程化神经桥接修复大鼠坐骨神经10mm缺损；2.术后12w，检测再生神经干动作电位，并计算神经传导速度；3.术后4w，6w，8w，10w和12w，测量并计算坐骨神经功能指数；4.术后4w、12w，采用免疫组织化学方法观察再生神经干的生长情况；5.术后12w，透射电镜观察再生髓鞘的厚度和髓鞘的板层数；6.术后12w，测量并计算靶肌横截肌纤维面积和单位面积胶原纤维百分数。7.术后4w，Westernblot检测再生神经干中细胞粘附分子N-cad

5、herin和周围髓鞘蛋白22（PMP22）的表达。结果1.组织工程化神经修复大鼠坐骨神经10mm缺损，术后12周，组织工程化神经组（nTENG）坐骨神经干复合肌动作电位（CMAP）与阳性对照的自体神经组（Autograft）相比没有显著差异,均明显优于丝素导管组(Scaffold)（P<0.05）。组织工程化神经组（nTENG）的神经传导速度（MCV）与自体神经组（Autograft）相比没有显著差异。2.术后12w，组织工程化神经组（nTENG）坐骨神经功能指数（SFI）与阳性对照的自体神经组（Autograft）相比无显著差异，均明显优于丝素导管组(Sc

6、affold)（P<0.05）。II组织工程化神经的体外构建及其修复大鼠坐骨神经缺损的研究中文摘要3.术后4w，免疫组织化学结果表明，组织工程化神经组（nTENG）与阳性对照的自体神经组（Autograft）均有成束的再生神经纤维形成；术后12w,再生神经纤维数量显著增加。4.术后术后4w和12w，组织工程化神经组（nTENG）与阳性对照的自体神经组（Autograft）再生髓鞘的厚度和髓鞘的板层数与对侧非手术侧的比率，均显著高于丝素导管组(Scaffold)（P<0.05）。5.术后12w，组织工程化神经组（nTENG）与阳性对照的自体神经组（Autogr

7、aft）的靶肌纤维的横截面积，显著高于丝素导管组(Scaffold)（P<0.05）；而胶原纤维占肌纤维的百分率，均显著低于丝素导管组(Scaffold)（P<0.05）。6.术后4w，组织工程化神经组（nTENG）与自体神经组（Autograft）N-cadherin的表达水平显著高于丝素导管组（P<0.05）；而PMP22的表达水平从2w开始显著高于丝素导管组（P<0.01）。结论1.组织工程化神经修复大鼠坐骨神经10mm缺损，复合肌动作电位、运动神经传导速度、髓鞘厚度和板层数等功能指标均优于丝素导管组，与自体神经组无显著差异，组织工程化神经修复周围神经

8、缺损明显促进损伤神经功能的恢复；2.组织工程化神经修