plga导管修复大鼠坐骨神经缺损的实验研究

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1、硕士学位论文材料与方法第一章材料与方法1．1实验动物与分组健康成年SD大鼠(Sprague-Dawleyrats)36只，由中南大学湘雅医学院实验动物学部提供，雌雄不拘，体重200___20g。用随机数字表法随机分为假手术对照组(n=12)和实验组：自体神经桥接组(n=12)和PLGA管桥接组(n=12)。1．2主要试剂和设备PLGA管(75：25)FastBlue恒冷低温切片机荧光显微镜手术显微镜Nikon数码相机微量注射器(1微升)u(B一11800修块机HPIAS-1000高清晰度彩色病理图像分析系统LKB一Ⅲ型超薄切片机图像分析

2、系统1．3实验方法1．3．1PLGA导管的制备3中南大学粉冶研究院Sigma公司ThermoelectroncompanyMoticCompany，GermanyGX．SS．22-3，中国上海Nikon，Japan上海医用激光仪器厂Sweden同济医科大学千屏影像工程公司SwedenMoticimagesadvanced3．2硕士学位论文材料与方法将PLGA(75：25)用三氯甲烷配制成10％溶液，用注射器注入预制模具中，室温下三氯甲烷自然挥发48h，期间适时脱模，制成长20砌、内径5．5锄、壁厚0．35咖的导管，干燥机内真空(20L／

3、h；-0．1Mpa)抽提溶剂24h，于真空干燥机内保存备用。1．3．2动物模型制备取体重200±20g的sD大鼠，以2％戊巴比妥钠(40mg／kg)腹腔注射，约5—10min后麻醉成功，俯卧位固定于自制(带固定胶带)的实验板上。剪去右后肢及右外侧鼠毛，经碘伏消毒，在右后肢后部用组织剪剪开皮肤约30咖，钝性分离皮下组织，沿股二头肌肌间隙暴露坐骨神经，分离神经周围结缔组织。在手术显微镜下自梨状肌下缘5mm处切除坐骨神经7咖，使其自然回缩形成10咖间隙。剪取长度略大于缺损距离的PLGA导管，两端套于坐骨神经两断端约1～2nun，用9一。纤维缝

4、线在两端各缝合2针，将神经连接于PLGA管上。放适量青霉素粉至切口内，分层逢合，碘伏消毒，术毕(见图1-1)。自体神经桥接组同上暴露坐骨神经后，原位切取7nln长的坐骨神经，远、近端对换后桥接于两断端神经缺损处，其余步骤同PLGA管桥接组。假手术对照组只是不切断坐骨神经，余步骤同实验组。术后分笼常规饲养，各组动物存活12周。1．3．3大体观察术后定期观察各组大鼠肢体状况：步态变化、溃疡的发生及愈合时间、肌肉萎缩和恢复情况、肢体感觉及自主运动恢复情况等。术后12周时，把各组大鼠分别置于一高20am、盖子直径为9．0cm的瓶子上观察手术侧后

5、肢功能恢复情况。术后12周时，自原切口切开暴露坐骨神经，观察桥接神经外观、表面粘连情况、再生神经粗细、有无神经瘤生成等。1．3．4步态分析于术后4、8、12周进行步态测量分析。简易步态分析装置的制作：先制作长60cm，宽10cm的长方形木槽，槽的一端接封闭纸箱，一端开口。上面加一可抽动的盖，槽内放入一张与行走箱等长、等宽的白纸。实验时盖上槽盖将双侧后足浸染炭素墨水的大鼠从槽开口端放入，大鼠将从槽开口端走向纸箱端，在白纸上留下其足印。测定以下3个变量：(1)足印长度(PrintLength：PL)：足印的4硕士学位论文材料与方法最长距离。

6、(2)足趾宽度(TotalSpreadingorToeSpread：TS)：第l～5趾连线的距离。(3)中间足趾宽度的距离(distancebetweenIntermediateToesorIntermediaryToeSpread：ITS)：第2～4趾宽度连线的距离。采用Bain等乜71的方法计算坐骨神经功能指数(SciaticNerveFunctionIndex，SFI)。SFI=--38．3(EPL—NPL)／NPL+109．5(ETS-NTS)／NTS+13．3(EIT-NIT)／NIT—8．8。公式中E代表实验侧，N代表正常侧

7、。SFI值o～±11表示神经功能完全正常，一100表示神经功能完全丧失，一ll～一100表示部分神经功能恢复。1．3．5小腿三头肌湿重于术后12周检测各组动物小腿三头肌萎缩情况，测定肌湿重恢复率(术侧小腿三头肌湿重／正常对照侧×100％)。将取材后的大鼠，在小腿三头肌的起止点切取肌肉，吸去血迹，去除结缔组织。用精密电子秤秤量，进行统计学处理，以评价再生神经对靶组织的支配程度。1．3．6FastBIue逆行荧光示踪术后11周时分别对各组大鼠做FastBlue逆行荧光示踪。具体步骤如下：2％戊巴比妥钠(40mg／kg)腹腔注射麻醉，固定，沿

8、原切口切开皮肤，暴露并探察桥接物两端的坐骨神经干及其分支，并结扎腓肠神经和股二头肌肌支(以防止荧光物质经旁路运输)。在距术侧远端吻合口以远约5咖坐骨神经干处注射2％FastBlue溶液0．6Pl，留针5mi