白斑综合症病毒WSSV原位PCR及定量PCR检测技术的建立

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1、中山大学硕士学位论文白斑综合症病毒（WSSV）原位PCR及定量PCR检测技术的建立姓名：简旭凤申请学位级别：硕士专业：水生生物学指导教师：何建国2003.6.3简旭风中山大学硕士学位论文中文摘要摘要用白斑综合症病毒(WSSV)粗提液注射感染凡纳对虾(Penaeusvanmnei)，感染后分别在2

2、lr、4hr、6hr、8hr、10hr、12}lr、14

3、lr、16hr、1811r、20hr、24hr、36llr、50hr取样，然后分别对样品进行一步PCR、二步PCR、原位杂交、原位PCR检测及定量PCR检测。结果表明：一步PCR法能检测出WSSV感染12hr后的样品；

4、二步PCR能检测出感染211r的样品；原位杂交能检测出感染18hr后的样品；原位PCR可检测出感染2hr以后的样品(五个样品中有一个能检出)。由实验结果显示，原位PCR方法的灵敏度比一步PCR和原位杂交高，而比二步PCR方法的灵敏度稍低。用该法对WSSV潜伏感染虾样进行检测，结果证明WSSV在凡纳对虾中的潜伏感染部位为肌肉及肝胰腺。通过对定量PCR条件优化的研究，建立了定量PCR检测技术。比较了WSSVI模板的制备方法，发现快速煮沸法简单、快速、效果好。船已建立的定量PCR技术，对患白斑综合症对虾的不同组织器官进行检测，WSSV感染组织的病毒量由多到少依次为：附肢一后

5、肠一鳃一表皮一眼一中肠一肌肉一心脏一胃一肝胰腺。对人工感染的对虾样品进行检测，结果显示每克对虾肌肉组织病毒量达lxl06拷贝时能用一步PCR和原位杂交检测，病毒量达lxl02拷贝时能用原位PCR和套式PCR检测。通过定量PCR的研究发现，对虾WSS发病需每克对虾组织1×106拷贝以上，潜伏感染病毒量仅为每克对虾组织lxl02拷贝。、／对WSSV致病机理作了初步说明及探讨。夕7‘关键词：对虾白斑综合症病毒Q配ss蝎，凡纳对虾，PCR，核酸探针，原位PCR，荧光定量PCR简旭风中山大学硕士学位论文英文摘要DevelopmentofInSituPCRandreal—time

6、PCRforWSSVJianXufengABSTRACTArtificiallyinfectPenaeusvanmneiwithWSSVbyinjection，samplingat0hr,2hr,4hr,6hr，8hr,10hr,12hr,14hr,16hr,18hr，20hr,24hr,36hr,50hrafterinfection．Thesamplesweredetectedbyone—stepPCR，two—stepPCR，／nSituhybridization(ISH)，／nSitupolymerasechainreaction(ISPCR)andreal—t

7、imePCR，andcomparisonofsensitivityamongthesemethodswasmade．Theresultsshowedthatone—stepPCRcalldetectsamplesafter12hrofinfection；two—stepPCRcandetectsamplesafteronly2hrofinfection；ISHcandetectthoseafter16hrofinfection，mainlyinfectedorgansincludedgill，epidermis，hepatopancreas，stomach，muscl

8、e，etc；ISPCRcandetectWSSVafter2hrofinfection，mainlyorgansofmuscleandhepatopancreas．AccordingtOtheresults，thesensitivityofISPCRishigherthanone—stepPCRandISH，butlowerthantwo—stepPCR(onlyonesamplescanbedetectedbyISPCR，whileall5samplesCanbedetectedbytwo·stepPCR)．UsingISPCRtodetecttherandomsh

9、rimpsfromanon—WSSoutbreakculturedpond，wefoundthatthemajororgansofWSSVlatentinfectionweremuscleandhepatopancreas．DifferenttissuesoftheWSSdiseasedshrimpweredetectedbyreal—timePCR．Theviralloadofthesetissuesisasfollowinginturn：pleopod，recta，gill，epidermis，eye，midgut，muscle，heart，st