快速检测牛病毒性腹泻病毒实时荧光定量pcr技术建立及应用

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1、快速检测牛病毒性腹泻病毒实时荧光定量PCR技术建立及应用快速检测牛病毒性腹泻病毒实时荧光定量PCR技术建立及应用　牛病毒性腹泻是由牛病毒性腹泻病毒（ＢＶＤＶ）引起的一种传染病，可引起许多临床症状和一些疾病，包括繁殖障碍、呼吸综合征、先天性缺陷、肠炎、持续感染（ＰＩ）和黏膜病（ＭＤ）等，易感动物除牛以外，还包括骆驼、绵羊、山羊、猪、鹿及多种野生反刍动物［１］。该病毒呈世界性分布，广泛分布于美国、澳大利亚、新西兰、匈牙利、加拿大、阿根廷、日本、印度以及非洲和欧洲许多养牛发达国家，是危害养牛业的重要病原之一。研究发现，其感染宿主涉及到了大部分偶蹄家畜和部分野生偶蹄动物。每年死于ＢＶＤＶ感染的牛不少

2、于５００万头，占饲养牛总数的０．５％～１．０％。ＢＶＤＶ感染怀孕母畜，造成胎儿产生免疫耐受，进而发展为持续性感染病畜，多数持续性感染动物外观健康，但生产性能下降，且成为重要的传染源。　　ＢＶＤＶ和猪瘟病毒（ＣＳＦＶ）同属黄病毒科瘟病毒属，基因组具有高度的同源性，能产生交叉免疫［２］。ＢＶＤＶ能感染猪，在全球广泛分布，对于无ＣＳＦＶ的国家（澳大利亚、爱尔兰、英国、丹麦），其猪群中ＢＶＤＶ抗体的阳性率在１．６％～４３．５％，而其他一些国家，阳性率更高。在我国，专家预测猪群中ＢＶＤＶ抗体的阳性率在５０％以上。ＢＶＤＶ在妊娠早期感染母猪，仔猪就会出现持续的ＢＶＤＶ感染，即胎儿通过胎盘感染，则仔猪形成

3、免疫耐受，且持续性感染。仔猪形成的这种免疫耐受，可严重抑制ＣＳＦＶ活疫苗的免疫应答，导致猪群猪瘟野毒的感染，从而暴发猪瘟，对我国的养猪业造成了巨大的经济损失。　　鉴于ＢＶＤＶ对我国养殖业（主要是养牛业和养猪业）造成的危害，建立一种准确、简便的ＢＶＤＶ病原检测方法，制定建议规程，对促进我国的养殖业健康发展、减少因该病引起的经济损失具有非常重要的意义［３，４］。实时荧光定量ＰＣＲ技术，是指在ＰＣＲ反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个ＰＣＲ进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法［５］。该方法以其高灵敏度、高特异性、快速等优点在病原体的定性和定量检测方面得到了广泛应用。本

4、试验应用荧光定量ＰＣＲ技术对ＢＶＤＶ病原进行快速定量检测，不但灵敏度比普通ＰＣＲ高，而且还避免了普通ＰＣＲ高污染率的缺点，因此，开展该方法的研究，将具有良好的应用前景［６－１０］。　　１材料与方法　　１．１材料　　ＢＶＤＶＮＡＤＬ株、牛肾传代细胞（ＭＤＢＫ）、ＤＨ５α感受态细胞为湖北省农业科学院畜牧兽医研究所实验室保存；猪瘟兔化弱毒疫苗购自武汉中博生物制品公司；牛拭子样品采集湖北省出现疑似牛病毒性腹泻病的牛场；ＤＭＥＭ培养液、新生牛血清为ＧＩＢＣＯ公司产品；ＤＮＡ凝胶纯化试剂盒和质粒小提试剂盒购自上海生工生物工程服务有限公司；ｐＧＥＭ－ＴＥａｓｙ质粒载体为Ｐｒｏｍｅｇａ公司产品；

5、Ｔ４ＤＮＡ连接酶为Ｐｒｏｍｅｇａ公司产品；ＥＸＴａｑＤＮＡ聚合酶为宝生物工程（大连）有限公司产品。　　１．2方法　　1.2.1阳性模板DNA的制备　　1）引物和探针序列。以ＢＶＤＶ的高度保守的５′端非编码区作为扩增靶区，设计并合成了一对引物和一条ＴａｑＭａｎ探针。具体序列如下：　　上游引物（Ｂ１）：５′－ＧＡＧＧＣＴＡＧＣＣＡＴＧＣＣＣＴＴ　　ＡＧＴ－３′；.L.　　下游引物（Ｂ２）：５′－ＴＣＣＡＴＧＴＧＣＣＡＴＧＴＡＣＡＧＣ　　ＡＧ－３′；　　探针序列（Ｂ）：５′－ＴＧＧＡＡＴＡＡＡＧＧＴＣＴＣＧＡＧＡ　　ＴＧＣＣＡ

6、ＣＧ－３′；　　探针修饰：５′－ＦＡＭ；（９）ＤＴ－ＢＨＱ；３′－ＰＯ４　　2）病毒培养。ＭＤＢＫ细胞经含１０％小牛血清和双抗（青霉素１００μｇ／ｍＬ、链霉素１００μｇ／ｍＬ）的ＤＭＥＭ培养液培养，待细胞长成７０％单层时，接种病毒液，３７℃吸附１ｈ，其间不时摇动使液面均匀地铺在细胞上，然后加含２％小牛血清和双抗的ＤＭＥＭ维持液，３７℃继续培养，在细胞病变达８０％以上时收获。3）常规ＰＣＲ。通过对ＰＣＲ反应条件与试剂的优化，确定如下反应方案：反应总体积为２０μＬ，其中１０Ｂｕｆｆｅｒ２μＬ，１０ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ２μＬ，引物

7、Ｂ１、Ｂ２各０．５μＬ（１０μｍｏｌ／Ｌ），ＤＮＡ模板２μＬ，ＴａｑＤＮＡ聚合酶０．５μＬ，加去离子水至２０μＬ。ＰＣＲ反应条件为：９４℃预变性，５ｍｉｎ；９４℃变性１ｍｉｎ；４５℃退火３０ｓ，扩增３５个循环；最后７２℃延伸１０ｍｉｎ。　　4）标准阳性模板的构建。用上述引物进行常规ＰＣＲ反应扩增ＢＶＤＶ阳性模板ＤＮＡ，ＰＣＲ产物回收纯化后克隆到ｐＧＥＭ－ＴＥａｓｙ载体中，构建重组