大豆和籽粒苋种子贮藏蛋白基因的克隆及植物表达载体的构建

《大豆和籽粒苋种子贮藏蛋白基因的克隆及植物表达载体的构建》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、沈阳农业大学硕士学位论文大豆和籽粒苋种子贮藏蛋白基因的克隆及植物表达载体的构建姓名：徐莉娟申请学位级别：硕士专业：植物学指导教师：郝建军;潘照明2003.6.1沈阳农业大学硕士学位论文摘要{大夏种子贮减蛋白(storageprotein)中大部分是球蛋白(globulin)，主要包潞豆球蛋白(1egumin)又称大豆球甏自(glycinin)和豌豆球蛋l!刍(vicilin】又称伴大豆球骚白(congtycinin)。它们的沉降系数分别为1lS和7s，故又分剐称为llS球蛋自和7S球鬣白。它们所编弼酶蛋白质富含9种人体必需氨基酸，其中t,ys含量较禾谷类丰

2、富。因此对人类具荫重要的营养和经济价值以及僳健功能0籽粒览(GrainAmaranth)种子不仅贮藏蛋白含量高，而且必需氨基酸禽量比较平衡，特别是豁类作物如水稻所缺少的Lys(熄其限制性氨基酸)，籽粒苋含量较蕊。萁氨基酸组成可与一般谷物互补。大豆和籽粒蔸种子贮藏蛋白基因的分离克隆可改良作物和培商新品种，并有助于对大豆和籽粒菀种子贮藏蛋白基函表达调控机制的研究。本研究是以我国的大豆薪品种和级苋为材料。用异硫氰酸胍盐法提取发育中期的子时总RNA，以萁为模板，敷久工合成的特髯弓f物避行PCR扩增。经琼脂糖电泳质，回收特异片段，克隆到pGEM．T载体上，筛选出重组

3、子以后，避行DNA序列分析及结构分析。}结果表明：(1)获得了编码大豆贮藏蛋白的基因(Gy)，其全长为1485bp，编码493个氨熬酸残基，与国外报道的大豆球蛋白罄因，箕核苷酸间源往为99．2％，氨基酸的同源性为98．4％。(2)获得了编码籽粒蓖贮藏骚白的基因(Am)，其全长未测通，只测了基因的两端的部分序硼。根据RT-PCR扩增产物的电泳知全长约1400bp。已测的序列与国外报道的贮藏蛋白基因序列，氨基泼同源性为89％。同时构建了适合于基因枪法转纯的编码Gy基因帮Am慕困的禳物表达载体pUGy和pCAm。卜，关键词：大露i籽粮苋；贮藏蛋白纂因?RT-PC

4、Rj植物表达载体前藩第一章前言近年来，随辫人们生活水平的提高以及对外贸易的开拓和国际农产晶市场一体纯所带来褥农产赫国际市场竞争的茄尉，作物营箨品质醑究及垂簧性被提高到前所未有的高媵。基因工程技术自20世纪70年代建立后，使得从不同植物晶种甚至微生物和动物中分离、纯讫的潜酶基因导入穗物已成为可能。在20世纪80年代主要是提高作物抗病性和抗虫性；在90年代，开始萃I蠲基闲工程技术改蘸作物营养晶质。早期对豆类贮减蛋白的研究以Osborne和Cambell(1898)的工作为最重要，发现了球覆自(globulin)和豌露球蛋自(vicilin)两种球蛋白。随后对大

5、豆种子研究发现，大豆种子不仅含肖丰富的蛋白质，而且宙有种类齐全的氨基酸，特莉楚含有9稀人体必需氨纂酸。1979年，蔺际原予税构和联合因粮农组织在维也纳召开了《改进禾谷类和豆类种子擞白的国际学术讨论会》，会议认为撬离释予蛋白的数量和藤蟹有巨大潜力。籽粒苋是苋料苋属檬物中的～年生粮食、饲料兼用作物，可作为食晶或营养成分添加裁，籽粒苋食品还蕻有明显豁傈诞动能。从60年代开始至今，研究结果表明，籽粒苋的种子鬣白质含掇高，而且必需氮基酸比较平衡。其t,ys含鬣远高于～般谷类作物，几乎秀～般谷褥的2—3僚(荞麦除井)。1990年，在荧国举行的美国第四次籽粒苋学术讨论会

6、和1991年在墨西哥举行的第一属潮际苋学术讨论会更说明了籽粒筵将成为一种新嫠的粮食作物。随糟谷类贮藏蛋白分子生物学研究的进展，已有可能借助转入外源的蛋白质基黼或对蘸因编码隗的可交序列遴行改造等方法，辩谷类鬣自质懂状进行分子淑良(王关林和方宏筠，1998；张宪银和薛庆中，2000)。1．种子贮藏甏鼠(storageprotein)的研究概瀛与进展1．1种予贮藏黻自的磷究概况种子贮藏鬣白按其在不同溶液中的溶解性不同可分为四类；(1)清蛋(Albumin)．．一类溶于水的种予蛋白，它包括许多功能蛋白，如酶、穰物凝集素、蛋岛酶抑制荆等。淀黼农韭天学磺士学髓滚文(2

7、)球鬣露(Globulin)：⋯类溶予稀箍静穗子蛋自，它怒双子}}l+植物种子的主螫贮藏蚤囱。(3)谷簧岛(Olutelin)：一爽溶予稀酸葳稀碱静种子蛋熬，它凳禾谷类律物矛孛予的主蘩贮藏骚自之一。(4)薛溶蚕1童(Prolamin)：一类溶予乙醇等青椒溶裁的种子蛋白。它违楚禾谷类{乍粥穗子静主黉贮藏餐囱之～。其中球礞盎、谷蟹露和醇溶鬣自又统称为种子贮藏器自。这耱对贮藏强自瓣分类楚Osborne予1924年所撬蹬静溶群菠分黉滚。谚濠曾存蚕自质分离纯亿方谣越过重要作鹰。隧蓉萃孛子贮藏蛋岛鏊因的克隆与穿捌分橱，壤蕊了蛋盘疆名字混乱斡状态。骸静子贮藏鬣宣酌分子谶

8、纯为蔽糖，板同源家羧进行缮黯质分爽的新方法解决了这一问题(臀庆平和