快速检测病毒的RBL细胞芯片

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1、圃幽密级：中国科学院大学UniversityofChineseAcademyofSciences博士学位论文研究所：2013年5月ARatBasophilicLeukaemiaCellSensorforRapidDetectionofViruses．ByQuMingshengDissertation／ThesisSubmittedtoTheUniversityofChineseAcademyofSciencesInpartialfulfillmentoftherequirementForthedegreeofDoctor／M

2、asterofPh．D．ofSciencesInstituteofMicrobiology,ChineseAcademyofSciencesMay,2013学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文不包含任何其他个人或集体已经发表或未发表的成果、数据或撰写过的科研成果，也不包含为获得任何教育机构的学位或证书已使用过的材料。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。申请学位的论文与资料若有不实之处，本

3、人愿承担一切责任。学位论文作者签名：牡朝幢加B年妇巧日学位论文使用授权声明本人完全了解中国科学院大学及微生物研究所关于提交、保存和使用学位论文的规定。同意研究所保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸制版和电子版，允许论文被查阅和借阅；论文保存单位及借阅人有义务保护论文作者及单位的知识产权。本论文的成果归中国科学院微生物研究所所有；本人离所后发表、使用本学位论文或与本论文直接相关的学术成果时，第一署名单位仍然为中国科学院微生物研究所。(保密论文在解密后遵守此规定)均D年手月叩日训弓年厂月1。J7日致谢六年的时间既短暂又漫长，在

4、快乐与煎熬中度过，却是我的人生旅途中最为充实、有着非凡意义的六年。首先谨以最诚挚的敬意感谢我的导师高斌研究员，从选题立题、实验设计到具体实验、结果分析直至文章撰写和论文的修改都凝结了导师的心血和智慧结晶。高老师严谨的治学态度、渊博的知识、创新的思维和敏锐的洞察力是我学习的榜样。衷心感谢中科院病原微生物与免疫学重点实验室的高福研究员和刘文军研究员在本人的研究过程中给予的指导和帮助。感谢王北难研究员、孟颂东研究员等、军事医学科学院的杨瑞馥研究员等在论文审阅过程中给我的指导。非常感谢高斌课题组刘长振老师、马娟、李伟、陶华老师和刘容

5、枝老师在我的学习和工作中给予的许多指导和帮助。感谢孟庆兰女士默默地为我们准备干净的实验材料，维持一个清洁的工作环境。感谢我们课题组与我朝夕相处的同学们刘庆军、丁洁、朱学锴、吴莹、贺文、韩化敏、王伟、王磊、赵云峰、王力飞、BhargaviM．Boruah、张鸽、牛歌、方良莹、陈源、马盼等。特别感谢BhargaviM．Boruah在英文论文撰写时的帮助、感谢王伟在电脑方面的帮助。我要对这六年来陪我度过难忘岁月的大家说声：谢谢!感谢在实验室工作的崔红莲、刘小立、史秋磊等。感谢你们在实验上提供的无私的帮助。感谢病原微生物和免疫学研究

6、室的毕玉海老师和张蔚、李燕、未金花等同学们给予我在实验上的帮助。感谢我的家人一直以来的支持和理解。感谢研究生处的高展老师、韩梅老师在这几年中中给予的很多帮助。感谢出席博士论文答辩委员会的各位专家、教授在百忙中给予的悉心指导!最后要感谢所有在这几年中帮助过我的人们。谢谢你们!瞿明胜V摘要大鼠嗜碱性粒细胞(RatBasophilicLeukaemia，RBL)是一种经典的肥大细胞模型，常用于过敏反应和lgE抗体的研究。特异性IgE抗体使RBL细胞致敏后，外来的过敏原刺激细胞快速发生脱颗粒反应，释放组胺、己糖苷酶、5．羟色胺等炎症

7、因子，引起过敏反应。基于这一特性，设计了一种RBL细胞芯片，用于检测和鉴定病毒。利用噬菌体展示技术筛选得到了特异性识别禽流感病毒H5N1或狂犬病毒的单区抗体(sdAb)，将sdAb与小鼠IgEFc段c3￡．C4E域融合，构建得到sdAb．Fc重组IgE抗体。抗体既能够特异性识别病毒抗原，又能结合RBL细胞表面的IgE高亲和力受体(FcR￡I)。sdAb．Fc抗体与RBL细胞结合后使细胞致敏，病毒样品加入后，会结合多个sdAb．Fc／FcRel复合物并使其在细胞表面聚集，FcREI的胞内段发生磷酸化并启动信号传导通路，开启内质

8、网的ca2+通道，释放大量的ca2+进入胞浆中，进一步激活下游的蛋白激酶，使细胞发生脱颗粒反应。胞浆中的ca2+染料Fluo．4与ca2+结合后，会发出绿色荧光。用荧光显微镜实时观察，RBL细胞可在病毒刺激后几秒钟内发出荧光信号，反应时间极短，整个检测过程可在3分钟内完成。研究表明RBL细