9.流感病毒的快速检测方法

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1、流感病毒的快速检测方法一、RT-PCR快速诊断方法（一）生物安全要求（二）病毒核酸提取（三）RT-PCR（四）PCR产物纯化（五）流感病毒RT-PCR检测引物二、免疫荧光方法检测流感病毒（一）原理（二）标本处理（三）间接免疫荧光法（四）结果判断三、实时荧光定量PCR（Real-TimePCR）快速诊断检测（一）基本原理（二）实验试剂（三）实验步骤四、快速诊断试剂盒流感的快速检测方法，与传统的病毒分离鉴定相比具有快速、简便的特点。因此常用于流感暴发时早期病原学检测用。流感的快速诊断包括直接和间接免疫荧光法、ELISA、RT-PCR、Real-TimeP

2、CR快速诊断速方法、流感快速诊断试剂盒等。这里介绍RT-PCR、Real-TimePCR、免疫荧光快速诊断速诊断方法和几种流感快速诊断试剂盒优缺点。无论那种快速诊断都无法代替传统的病毒分离鉴定方法。一、RT-PCR快速诊断方法核酸检测是一种鉴定流感病毒基因组的有力方法，即使基因组含量很低或死病毒也可以检测到。本章将介绍检测流感病毒的聚合酶链式反应（PCR）。流感病毒的基因组是负链RNA，在进行PCR扩增前必须合成与病毒RNA互补的DNA，即为cDNA。逆转录酶（RT）就是用于合成cDNA的多聚酶，因此，扩增流感病毒基因组的过程称为RT-PCR。RT-

3、PCR需要一对型别特异引物，四种脱氧核苷酸（dNTPs），RNA模板，逆转录酶及TaqDNA多聚酶；首先由逆转录酶将病毒的RNA逆转录合成cDNA，然后再进行聚合酶链反应经25～30个循环，使DNA产物达到倍增的效果。（一）生物安全要求生物安全级别与个人防护要求：生物安全二级实验室，防护要求与二级实验室的要求相同。并应遵守相应的生物安全规定。进行高致病性禽H5RT-PCR快速检测时可以在生物安全二级实验室里进行，核酸提取在生物安全三级实验室的生物安全柜里完成。（一）病毒核酸提取1.实验材料及仪器(1)QIAGEN公司的RneasyMiniKit（Ca

4、talog#74104）(2)β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol）(3)70%乙醇(4)无菌1.5ml离心管(5)10μl、20μl、200μl、1000μl加样器和枪头(6)可调14K微型离心机(7)旋转混合器2.操作步骤(1)取1支无菌、无RNA酶的1.5mlEppendorf管，加入500μlRLT。(2)取采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚尿囊液或细胞培养液）100μl，加入上述Eppendorf管中。(3)加5μlβ-巯基乙醇，充分混匀。(4)加600μl70%乙醇，于旋转混合器混匀。(5)从试剂盒中取出带滤膜

5、的离心柱，并标上标本号。(6)将第4步的混合液体分两次（每次600μl）吸入于滤柱中，12000rpm离心15秒，弃收集管中的离心液。(7)滤柱仍放回收集管上，将第4步的混合液全部吸入滤柱中，12000rpm离心15秒，弃收集管中液体。(8)于滤柱中加入700μlRW1，12000rpm离心15秒。(9)从试剂盒中取出一支新的2ml收集管，将离心后的滤柱转到新的收集管上，于柱子中加入500μlRPE，12000rpm离心15秒弃收集管中液体。(10)滤柱放回收集管上，于滤柱中加入500μlRPE，13000～14000rpm离心2分钟。(11)从试剂

6、盒中取出一支1.5mlEppendorf管，将滤柱转到新的1.5ml管上，于滤柱中加入30～50μl无RNA酶的水，室温静置1～3分钟。(12)12000rpm离心1分钟，弃滤柱。收集的离心液即为提取病毒的RNA，可以直接用于逆转录实验，或在-20℃以下保存，-30℃可保存3～4个月。3.注意事项(1)试剂盒中的RPE液用前需加44ml无水乙醇，使终体积达到55ml。(2)所有用过的枪头、收集管放入2%次氯酸钠消毒缸中过夜。（二）RT-PCR1.一步法RT-PCR(1)实验材料1)QIAGENOneStepRT-PCRKitCatNo2102122)

7、RNaseinhibitor40u/μl（Promega）3)上游引物200ng/μl4)下游引物200ng/μl1)模板RNA（TempletRNA）(2)实验步骤1)PCR反应配置（在清洁区缓冲间，加RNA模板应在核酸室）无RNA酶水（RnaseFreeWater）28.75μl5×Buffer10μl10mMdNTP2μlEnzymeMix2μlRnaseinhibitor0.25μl上游引物1μl下游引物1μlRNA模板5μl总量：50μl2)将PCR反应管放入PCR扩增仪3)RT-PCR反应条件：此循环的反应条件仅共参考，如果引物更换，相应

8、的反应条件需要做适当调整。®60℃1min®42℃10min®50℃30min®95℃15min®94℃30