马铃薯病毒与类病毒检测芯片的制备及应用

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1、查堕查兰堡主兰垡丝苎——摘要马铃薯在全世界79％的国家广泛种植，其经济价值在世界作物中占第四位。目前在马铃薯作物上己发现的病毒、类病毒多达30余种，是影,r自--5铃薯产量和质量的主要病害，引起的常年马铃薯产量损失达15％-20％。因此马铃薯病毒检测及其如何利用基因工程手段进行防治引起了各国的极大重视。开发高通量、快速、灵敏、规范化的检测体系是病毒检测发展的必然方向。基因芯片以其高通量、高信息量、且自动化程度高的特点成为检测病毒核酸的最佳方法之一。本研究通过RT．PCR和克隆、测序，在各地马铃薯样品上获得了三种病毒分离物(PVA、PVY、TMV)的3

2、’·末端cDNA片段和类病毒PSTVd的两个分离物基因组全序列。并通过与不同地区来源的病毒分离物的相应序列的同源性比较进行了归组研究，分析结果表明：从CP基因核苷酸水平，可以将PVA分为3组、PVY分为4个株系、TMV分为三组；PS-I'Vd的基因组序列较为保守，可以分两个亚组。对序列变异与地区来源之间关系的分析结果表明：PVA的基因变异与地区来源关系不大，PVY的各株系内的分离物表现出一定的地区适应性变异，TMV和PS"rVd有通过基因组RNA的突变适应地域的趋势。本课题针对侵染马铃薯的十种主要病毒、类病毒(TMV、AIMV、CMV、PVA、PVX

3、、PVY、PMTV、PVM、PLRV、PSTVd)检测芯片的制作和应用方面进行了深入的研究，并制备了相应的病毒检测芯片，取得了较为满意的结果。我们首先参照文献设计了能特异扩增靶序列的引物和特异性探针，设计制各了可以同时对上述病毒和类病毒进行检测的集成式芯片。并对从染病植物组织中提取出的RNA进行PCR扩增，同时标记荧光。为了使操作简化，我们探索了一步反应的RT标记技术，实现了对四种病毒(CMV、TMV、PVX、PVY)的四重RT标记。在芯片杂交过程中系统摸索并优化了杂交温度、杂交模板等对杂交结果的影响，制备的芯片可以同时检测7种病毒和类病毒，并且没有

4、交叉杂交信号。本课题还进行了玻片固定总RNA的初步研究：探索了～种能在经过修饰的玻片上直接点上样品总RNA，并与特定病毒或类病毒的相应荧光标记的探针进行杂交检测的方法。与膜杂交相比，具有一次性检测量大，时间少，无辐射等优点。本研究以CMV为检测对象，对玻片固定RNA的方法、水合温度、荧光标记探针的长度等对杂交效果的影响进行了探索。将该方法应用于40个马铃薯样品的PSTVd的检测分析，结果表明其准确度超过膜杂交方法。【关键词】：马铃薯、病毒、类病毒、基因芯片、病毒检测查壹查兰堡主堂竺笙三生——————————————一AbstractPotatoiSa

5、kindofpopularandimportauteconomicplantthatgrowsinmostofcountriesoftheworld．Thediseasescausedbyvirusesorviroidsbringaboutsubstantiallossesinagriculturalproduction．Therearemorethan30virusesandviroidscaninfectpotato．TheproperdiagnosisofcausativevirusesandviroidsiSthefirstrequireme

6、ntforthecontrolofsuchdiseases．Sodevelopingahi曲throughput，rapid，sensitiveandspecificmethodisnecessaryGenechip，givingalargeamountofsequenceinformationdirectlyandsimultaneously,hasbecomeoneofthebestsolutionstodetectvirusgenes．Inthisstudy,usingRT-PCRandcloningmethod,wegotthe3’endse

7、quencesofgenomeofthreekindofvirusisolates(PVA，PvYandTMV)，anda11sequenceofgenomeoftwoPSTVdisolateswhichwerefoundinpotato．Theabovesequencedataobtainedinourstudywerethencomparedwithpreviouslyreportedsequencesofotherisolatesobtainedfromotherpartsoftheworld．ThePVAisolateswerethenfou

8、ndbelongingtothreegroupsaccordingtonucleicacidsimilari