马铃薯类病毒PSTVd分子鉴定及中国分离株系的克隆与序列分析

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1、东北农业大学硕士学位论文马铃薯类病毒（PSTVd）分子鉴定及中国分离株系的克隆与序列分析姓名：吕典秋申请学位级别：硕士专业：作物遗传育种指导教师：吕文河2003.6.1目录摘要对采自中国东北佳木斯、大庆等地区具有典型马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)症状的薯块样品进行往返电泳(R-PAGE)，确定含马铃薯纺锤块茎类病毒的阳性样品。利用R-PAGE进行PSTVd检测，灵敏度可达到13ng。同时，利用双向电泳和RT—PCR方法进行类病毒鉴定，证明两种方法均可用来检测类病毒。利用含PSTVd单体的pGEM-7Z质粒，通过PC

2、R扩增技术，用生物素标记制备cDNA探针，进行杂交反应检测PSTVd，其中通过化学颜色反应进行判读灵敏度可达到50pg，而用化学发光反应进行判读灵敏度可达到5pg，分别是R-PAGE检测灵敏度的260倍和26倍。且两种反应特异性和专化性较强。cDNA核酸斑点杂交反应(NASH)检测PSTVd方法准确、灵敏度高，一次检测样品数量多，且对于异地样品检测非常方便，是以往其它检测方法的有效补挑选白斑进行双酶切(SacI／EcoR矿)鉴定证明插入片段为359bp大小，进行序列测定，所得克隆基因为PSTVd全序列负链，大小为359

3、bp。该中国株系和北美弱株系序列相同，同源性100％，因此判断田间发病的为PSqWd弱株系。从而进一步推测中国PSTVd的发生可能是随着IrishCobbher品种引入我国而带来的。该中国分离株系与印度弱系和美国性强、灵敏度高的cDNA探针，建立了完整的PSTVd鉴定体系和操作流程。在国内，首次对中国分离株系进行cDNA蕃国裹瞧和序列分析，进一步验证了中国株系的由鲞璺苎譬构特点，对于中国在PSTVd检浏水平的提高、检测试剂盒制备、PSTVd的防治及其致病机理、转基因育种等提供重要依据。关键词马铃薯类旖每；鉴定；株系：克

4、隆：序，Ⅸ析tl太末j￡表藏大学衷学嫒圭孝垃{象文MolecularDiagnosisofPotatoSpindleTuberViroid(PSTVd)andeDNACloningandSequenceAnalysisoftheIsolatefromChinaAbstractA鞋thesampleswithtypicalpotatospindfetllber《mid球STVd)symptomscollec拇dfromthefieldsinthenortheastregionofChinaweredetectedbyth

5、eR-赫GEmethod，R1epositivesampleswereverified．Then．two．dimensionalPAGEandRT-PCRteehniqueswereadaptedindetetingPSTVd．Theresultsshowedth融botll2．D—PAGEandRT-PCRwerefeasibleinpSTVddetection。PGEM一7Zwi协themonomericpSTvdcDNA(359bplWasused鹬atemplateandthedUTPWaspanicallyr

6、eplacedbybiotin-11．dL，rP．TheeDNAprobewaspreparedbyPCRamplificationtechnique。Colorimetricandchemilumineseentdetectionforbiotinylatedprobewereusedin氇istest．TheYwerecapableofdetecting50pgOfpurifiedtotalRNAbyacolorimetricassayand5pgbyachemiluminescentassay．Thenonrad

7、ioactiveprobeproducedwithPCRamplificationwereparticularlysuitableforpracticaldiagnosis，astheyaresensitiveandCanberapidlypreparedinlargcquantities．Thetwoassaymethodswere260timesand26timesassensitvityasR-PAGErespectively．Todeviceaprimerpairsandampli村thefuIlIengthP

8、STVdbyRT．PCR，thepositiveRNAextractionfromtubersamplewasusedastemplate．Tl撼product《l盯-PCRwaspurifiedandconnectedtotheplasmidpMD18-Tvector．Then．theplasmidWaStransformedi