高压氧对脑缺血再灌注小鼠血脑屏障通透性的影响

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1、中国医科大学博士学位论文高压氧对脑缺血再灌注小鼠血脑屏障通透性的影响姓名：赵红申请学位级别：博士专业：病理学与病理生理学指导教师：张海鹏2003.3.1中文摘要目的血脑屏障(BloodBrainBarrier，BBB)是由内皮细胞的紧密连接，基膜及星形胶质细胞组成一个位于脑和微血管之间的物质调节界面，对进出的物质具有选择性通过作用。血脑屏障的破坏是脑缺血再灌注(ischemiareper．fasion，IR)脑损伤的重要的病理生理基础。脑缺血再灌注早期，伴随着细胞因子，粘附分子的表达，特别是促炎因子IL—lB、TNFa、IL一6、IL一8使缺血性损伤向炎症性损伤转变，

2、其中抑制因子IL—10在IR损伤中也起到抵抗炎症反应的作用。炎症和免疫反应在脑缺血再灌注的病理生理中起重要作用，包括白细胞浸润，巨噬细胞激活等。自细胞激活后产生大量的蛋白水解酶，氧自由基和其他效应分子，导致脑毛细血管内皮细胞及其基底膜损害，破坏BBB的完整性，导致BBB的通透性增加。高压氧(hyperbaricoxy-genation，HBO)作为治疗缺血性脑血管疾病中的一种非创伤性手段在临床上正得以应用。它具有改善组织缺氧，维持细胞能量代谢，减轻脑水肿作用，僵HBO在脑缺血再灌注损伤中对血脑屏障通透性的影响研究甚少，本研究从细胞水平，分子水平，基因水平进一步探讨高压

3、氧在脑缺血再灌注损伤中对血脑屏障通透性的影响，为临床上应用高压氧治疗缺血性脑血管疾病提供有力的实验依据。方法1．脑缺血再灌注模型的复制：采用清醒小鼠颈部手术分离双侧颈总动脉，用橡皮泥固定拉紧丝线，阻断双侧颈总动脉血流30分钟，松线后，无菌缝合颈部皮肤。假手术组与HBO组只作颈部手术，不阻断颈总动脉血流。2．实验鼠的高压氧处理：高压氧组与高压氧+脑缺血再灌注组于术后2h、9h、21h、45h、69h进入HBO舱内，待动物进舱后，先用纯氧洗舱10分钟，使舱内O：浓度>90％，加压速率为0．0125MPa／min，加压至0．25MPa，在高压氧状态下停留60分钟，其间用纯氧

4、通气10分钟。停留毕，以20分钟匀速减至常压。3．脑皮质血流检测：用激光多普勒血流仪监测脑皮质血流，打开颅腔，选择测定脑血流，于缺血前、缺血10分钟、20分钟、30分钟，再灌注4小时、1l小时、23小时、48小时、72小时分别测定脑皮质血流值。4．组织依文思兰(Evansblue，EB)定量测定：参考UdakaK．法。在处死动物前1小时经尾静脉注射2％Evans兰，在检测前20分钟进行在体心脏灌注，直至心房流出清亮的液体为准。术后4小时、11小时、23小时、48小时、72小时处死小鼠，摘取脑组织用电子天平精确秤其湿重后，投人中号试管中，分别加入3ml甲酰胺，加盖后于4

5、5℃的水浴箱孵育48h，轻轻摇匀，离心15min(3000r／min)，取上清液在722型光栅分光光度计比色(入=632nm)。5．ABC—ELISA法检测细胞因子的含量：术后72小时处死小鼠于冰盘上快速剥离脑部组织，以冰冷的PBS冲洗，滤纸吸干，立即于电子天平秤重，配成10％脑组织匀浆，匀浆液于4℃4000r／min离心15分钟，取上清液，采用双抗体夹心ABC—ELISA法在波长492nm处检测IL一1B、TNFa、IL一6、IL一8、IL—lO的含量。6．明胶酶谱法活力测定：取海马区的脑组织经匀浆离心制成蛋白质抽提液，取20ul上样于含5mg／ml明胶的聚丙烯酰胺

6、凝胶中，20rnA恒流电泳，电泳后，将凝胶于2．5％的TritonX—100液内振荡37℃，1小时，酶缓冲液(50mmol／1Tris，PH7．5；200mmol／INaCl；500mmol／1CaCl2)内孵育37℃，42小时。孵育结束后经染色液(0．05％考马斯亮蓝、30％甲醇、10％乙酸)染色3小时，及脱色液A、B、c(甲醇浓度为30％、20％、10％；乙酸浓度分别为10％、10％、5％)分别脱色O．5、1、2小时显示出MMP一2和MMP-9位于蓝色背景上的透亮带。7．抗氧化酶类(GSH—PX、SOD、CAT)及NOS活性和丙二醛(MDA)含量的测定：予再灌注7

7、2小时处死小鼠，予冰盘上取海马区的脑组织，置匀浆管中，加入预冷的生理盐水若干毫升，用匀浆器制成10％的匀浆，用台式高速离心机以10000r／rain离心5min取上清液。用NOS、GSH—PX、SOD、CAT、MDA测试盒分别在入=530nm、入=412nm、入=550nm、入=405llm及入=532nm处检测酶活性及丙二醛的含量。、8．RT—PCR法检测脑组织中细胞因子的表达·2·8．1脑组织总RNA抽提：同异硫氰酸胍“一步法”提取。取海马区脑组织0．1克量／mlTRIzol中于冰上匀浆后，放置10min，取上清加氯仿200ul，轻摇混匀，4℃离