犬下颌骨牵张成骨中髁状突软骨改建与细胞外基质变化的实验研究

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第四军医大学硕士学位论文犬下颌骨牵张成骨中髁状突软骨改建与细胞外基质变化的实验研究姓名：张春光申请学位级别：硕士专业：口腔临床医学（口腔正畸学）指导教师：丁寅2003.5.1 独剑性声明秉琢学校严谨螅学风与优良的科学道豫，本A声明所呈交的论文攫获个A导师指导下进行的研究工作及取得的研究成莱。尽找所知，豫了文巾特别舯菰洼秘致溪豹莲鸯舞，论文誊奉鬈龛共稳大琶经炭壤藏撰写遵魏磺究壤豢，包含本人或他人笆申请学位或共他甩遽捷用过的成果。与藐一同工作的愿态本研究所谳的任何贡献瑚已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。牵潺学整论文与资辩善育事实之建，奉太黎撵一援褪关羹{王。论文作者签福：丝盎垫日弼保护知识产权声明本A完全7解繁蠼军医大学蠢关壤护艇识产投熬攫是，溪：磅蹇生褒技玻续位捌阊论文I作的知识产权单位属第四军医大学。本人保证毕业离校后，发论交鲮蓑焉论交I挥藏莱精誓箬擎往掇熬为第露军嚣大学。学校有袄谦瞽送论文蚂复娜摊，龛{錾谂文按查强棚舞强；学较霹骥公蘩论文鹁全耱鼗熟分耀(保密内容踩外)，可以来用影印、缩聊或其他复嗣手段保存论文。蝴粼：逝等懈：≯吼业 墨婴呈墨查兰堡主兰堡垒奎一——犬下颌骨牵张成骨中髁状突软骨改建与细胞外基质变化的实验研究硕士研究生：张春光导师：丁寅教授第四军医大学口腔医学院正畸科中文摘要／自从意大利学者Codivilla于1905年首次报道牵张成骨术(distraction、osteogenesis，DO)以来，关于此项技术的研究方兴未艾。其中，在下颌骨牵张成骨对颞下颌关节的影响这一问题上，国外学者持不同意见，国内少见相关报道。l本实验以14只替牙列期杂种犬为研究对象，设立实验组和对／照组，建立双侧下颌体牵张成骨动物模型；采用扫描电镜、组织化学和免疫组化等方法，观察犬双侧下颌骨牵张成骨中髁状突软骨细胞外基质的改变，进一步探讨下颌骨牵张成骨对颞下颌关节的影响，为下颌发育不良畸形的临床治疗提供理论依据。，f本研究共分三部分：、I．犬双侧下颌骨牵张成骨中髁状突软骨的组织学改建研究结果：犬髁状突后区表面的凝胶样物质被破坏，严重的会暴露出下面疏松的、排列紊乱的胶原纤维；后期髁状突出现组织改建，表面结构可基本恢复正常。结论：双侧下颌骨牵张成骨可以引起髁状突软骨暂时性的超微结构改变，但在适宜的牵张速率等条件下，这种改变是可逆的。2．犬双侧下颌骨牵张成骨中髁状突软骨I、III型胶原变化的研究 第四军医大学硕士学位论文结果：犬髁状突软骨中I型胶原的表达增加缓慢，至牵张结束8周仍有超常水平；III型胶原的表达随时间的延长逐渐增加，至牵张结束4周达到顶峰，随后逐渐减弱。结论：在犬双侧下颌骨牵张成骨中，髁状突发生适应性改建，表现为软骨细胞合成及分泌胶原的能力发生改变。3．犬双侧下颌骨牵张成骨中髁状突软骨细胞外基质变化的研究结果：犬髁状突软骨中、后区胶原蛋白和蛋白聚糖含量在下颌骨牵张结束后都明显降低，8周后二者均有所增加。结论：在双侧下颌骨牵张成骨中，局部关节软骨细胞外基质含量减少，在持续较长时间后，含量会基本恢复正常。／7∥本研究结果表明，在犬双侧下颌骨牵张成骨术中，髁状突软骨经历了一个组织变化和趋向恢复的改建过程。其中，髁状突软骨细胞外基质的含量和成分出现较明显的改变，并且这些改变是可逆的。以上结果也充分说明：髁状突有较强的改建能力，在适宜的牵张速率和时间等条件下，髁状突会建立新的平衡，维持其相对正常的功能。关键词：牵张成骨：扫描电子显微镜；I型胶原；III型胶原；髁状突细胞外基质：蛋白聚糖2 兰堕呈堡查兰堡主兰垡笙苎——StudvoftheeffectofmandibulardistractionosteogenesisonthetissueremodelingandthechangeoftheextracelluarmatrixofcaninecondylePostgraduate：ZhangChun-GuangTutor：ProfessorDingYinDepartmentofOrthodontics，StomatologicalCollegeTheFourthMilitaryMedicalUniversity，Xi’anAbstraetAsanewtherapymethodthatwasintroducedbyCodivillafromItalyin1905，distractionosteogenesis(DO)hadbeenundergoingalongwaytothrive．Theresearch0nthisareahasnotbeenstoppedyet．Theconclusionsofstudiesfromabroadontheeffectofmandibulardistractionosteogenesis012TMJshowedgreatdifferences，andrarerelativestudywasseenbynowinland．Inthisstudy，fourteenyoungcanineswiththeage&fourtosixmonthsoldwereadoptedtoestablishmodelsofbilateralmandibulardistractionosteogenesis．Thentheeffectofmandibulardistractionosteogenesisontheextracelluarmatrixofcaninecondylewasstudiedwiththesemodelsbymeansofscanningelectronmicroscope，immunohistochemicalandhistochemicalmethods．ThisstudywasafurtherresearchontheresponseofTMJduringDO，anditmayoffertheexperimentalbasisfortheclinicaltherapy．Thestudyconsistsofthreepans：1．Ultrastructurechangesofcondylefollowingmandibulardistractionosteogenesis3 第四军医大学硕士学位论文Results：TheagglutinatingsubstancesofthecondyledecreasedandbecameirregularsoonafterDO．Thesurfaceofcondylewaspartlydestroyed；theunderlyingcollagenfiberswereloosed，orevenworsedisorderedandexposed．8weekslater，thesurfaceofcondyleresumedandlookedlikethenorrnalstructure．Conclusion：Mandibulardistractionosteogenesisperhapscausesatemporarilynegativeeffectonthecondyle，whichwillundergoalongremodificationprocesstoberesumed．2．Immunohistochemicalstudyoftype1and1IIcollagenincondyleinmandibulardistractionosteogenesisResults：TheexpressionoftypeIcollagenincreasedmoreslowly．Ontheotherhand，typeIIIcollagenincondylarcartilagewasenhancedafterthecompletionofthedistraction．TheexpressionofthetypeIIIcollagenroseitssummitatthe4thweek，andthendeclined．Conclusion：ThechangesoftypeIandIIIcollagenmayindicatetheremodelingoftemporomandibularjointafterthemandibulardistractionosteogenesisbystimulatingthecollagensynthesisandthesecretionofcartilagecells．3．HistochemicalstudyonthemandibularcondyleindistractionosteogenesisResults：Theproteoglycanexpressionwasweakenaswellascollagenafterthecompletionofthedistractionandgottoitsminimumatthe4thweek，andtheninereased．Conclusion：Mandibulardistractionosteogenesismaycausethechangeoftheextracelluarmatrixinmandibularcondyle，whichexistsintheremodeling4 第四军医大学硕士学位论文oftemporomandibularjoim．Fromthisstudy，wecallconcludethatthemandibularcondylesgothroughaprocessofextracelluarmatrixalterationandremodificationduringdistractionosteogenesis．Ailewbalancewillbeestablishedinmandibularcondyletomaintainitsrelativelynormalfunction．Keywords：Distractionosteogenesis；Scanningelectronmicroscope；CondyleTypeIcollagen；TypeJIIcollagen；Extracelluarmatrix：Proteoglycan5 第四军医大学硕士学位论文前言牵张成骨(distractionosteogenesis，DO)是通过对骨切开后仍保留骨膜及软组织附着和血供的骨段，施加特定的牵张力，以延长或扩宽骨骼，达到矫治骨骼畸形或缺损的外科技术。牵张成骨术早期多用于治疗四肢骨的缺损或畸形患者，它在颅颌面外科的研究和应用较晚。直至1973年，Snyder才在动物实验中首先进行了下颌骨牵引延长，后来McCarthy又开展了临床下颌骨延长术，DO技术在颅颌面部的实验及l临床应用研究才得到了迅速发展。多年来，许多学者应用各种动物模型及牵引方法进行了一些实验研究，其中大多数集中在DO中骨质的新生研究、牵张器的设计、牵张方法的改进等方面，而对于DO对颌面部周围组织的影响的研究内容偏少，结论不一。随着DO临床实践的广泛开展，临床医生关注的重点不仅仅是缺损骨段的骨质新生问题，他们越来越重视DO对颌面部周围组织的影响，以期更多的减少或避免由DO导致的副作用，进而完善此项技术，更好地为患者服务。本研究是在以往研究的基础上，结合实际条件，选择14只替牙期杂种犬为研究对象，设立实验组和对照组，建立双侧下颌骨DO动物模型；采用扫描电镜、组织化学和免疫组化等方法，观察犬双侧下颌骨DO中髁状突组织改建及髁状突软骨细胞外基质主要成分的改变，进一步探讨双侧下颌骨DO对颞下颌关节的影响的机理，为下颌发育不良畸形的临床治疗提供理论依据。6 第四军医大学硕士学位论文文献回顾第一部分髁状突软骨细胞外基质的组成及功能软骨细胞外基质(extracelluarmatrix，ECM)由密集分布排列的胶原纤维、各种蛋白聚糖、氨基聚糖、糖蛋白、结合水和阳离子等组成⋯。胶原纤维约占关节软骨干重的50％，主要提供抗张强度，蛋白聚糖则起固化及抗压作用，二者相互作用，稳定关节软骨细胞外基质并结合水。基质水被嗜水性蛋白聚糖聚合体所吸引，呈压力依赖性流动，其主要作用是抗压、恢复受损软骨的正常形态以及保持润滑。1．胶原胶原(collagen)是细胞外基质的结构蛋白质。至今文献已报道】9型胶原，由33个基因编码12】。按其分布可分为(1)间质胶原，主要是I、II、Ⅱl、Ⅷ型胶原，均分布于各种细胞和组织之间；(2)基膜胶原，以Ⅳ型胶原为主，呈网状分布于基膜中；(3)细胞外胶原，如V、Ⅶ型胶原等，参与细胞外骨架的构成。其中，纤维性胶原(I、Ⅱ、III型)的分子结构和DNA序列已为人所熟知。I、II、III型胶原的分子式分别是[n2(I)]2n2(I)、[al(II)】3、[nfflII)]3。胶原是由粗面内质网合成的分泌蛋白，它的合成是一个相对复杂的过程。首先由核糖体合成前a链，在选择性的羟化和糖基化以后，形成三股螺旋的前胶原分子，在切去前肽后成为胶原分子。许多胶原分子装配成胶原原纤维，这些原纤维聚集成束形成胶原纤维【3】。关节软骨组织中至少存在五种类型的胶原，即II、Ⅵ、Ⅸ、X和Ⅺ型胶原，其中II型胶原的含量最多。这些不同类型的胶原分子聚合形成软骨细胞外基质的网状结构。II型胶原又分为IIA型和IIB型，IIA型前胶原较长，由软骨干细胞和多种非软骨组织合成，对软骨细胞的早期分化起一7 第四军医大学硕士学位论文定作用。IIB型前胶原较短，由成熟的软骨细胞合成，是软骨中的主要胶原成分【引。II型胶原在软骨细胞外基质中形成纤细的网状结构，对软骨负重后的机械稳定起到极为重要的作用。1I型胶原是软骨细胞外基质的主要特异性成分，是成熟软骨细胞分化的典型标志【5】。Ⅵ型胶原在体内分布较广泛，在软骨主要分布于软骨细胞周围区域，对组织连接起重要作用。1X型胶原主要分布于软骨细胞周围，它通过一个氨基多糖侧链与软骨中的II型胶原共价结合，对维持软骨细胞外基质的结构完整性起着重要作用【6J。X型胶原分布局限在肥大的软骨细胞和软骨骨化的软骨细胞外基质中，主要由软骨骨化过程中过度肥大的软骨细胞合成，在软骨内骨化中起重要作用【71。Ⅺ型胶原与II型胶原具有同样的原始结构。它可能在II型胶原周围形成网架结构或者分散在纤维之间，在软骨胶原纤维装配过程中起调节作用【81。多数关节软骨为透明软骨，II型胶原为其主要成分，而颞下颌关节为适应生物力学、生理等功能需求，有其特定的纤维软骨，呈现出以I、II、III型胶原为主，其他胶原并存的分布规律19、101。I型胶原几乎分布于关节的各个组成部分，在髁状突的骨上组织表现为由表及里含量渐少[1131II型胶原主要分布在髁状突软骨、关节盘、颞骨关节面的软骨样组织等；III型胶原分布于关节盘、髁状突软骨、关节结节表面等。髁状突软骨中的I、III型胶原的含量变化可反映髁状突的改建能力。有人认为细胞表达I、III型胶原蛋白的比例变化可反映组织或细胞的分化成熟状态。当组织炎症或创伤修复时，早期修复时主要合成的胶原蛋白是IⅡ型胶原，以后逐渐为I型胶原所代替[12]o也有学者发现，在骨关节炎的关节软骨中，I、1II型胶原可存在于软骨细胞及周围基质中。随着病变的发展，I型胶原的含量量会增加，I型胶原的局部增多提示软骨组织趋于纤维化和骨化【l引，使软骨失去原有弹性。如果异常负荷持续存在，会导致8 第四军医大学硕士学位论文不可逆的病理改变。另外，从组织结构而言，髁状突软骨中胶原纤维分三层：表层、中层及深层。表层纤维与软骨表面平行，能承受较大的负荷。中层胶原纤维呈网状排列，这种结构有利于胶原网络蛋白聚糖大分子，并在功能运动时通过其形态的变化来限制间隙液的流动，产生强大张力平衡载荷，同时使自身承受较小载荷，免受损伤。深层胶原纤维则缠绕在一起，形成大的纤维束，深入到钙化区形成软骨与骨的支架，起稳定作用[143。2．氨基聚糖和蛋白聚糖2．1氨基聚糖(glycosaminoglycan)它又被称为氨基多糖、糖胺多糖等，是由重复的二糖单位构成的长链多糖。二糖单位之一是氨基己糖，一般是氨基葡萄糖或氨基半乳糖；另一个是糖醛酸。氨基聚糖包括透明质酸、4一(6一)硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素和肝素等C15]。其中透明质酸(hyaluronicacid)通常是由多达5000个二糖单位(葡萄糖醛酸9(1—3)N一乙酰氨基葡萄糖)组成的一种重要氨基聚糖，是增殖细胞和迁移细胞胞外基质的主要成分。由于其分子表面含有大量亲水基团，可结合大量水分子：再加上分子表面羧基基团结合的阳离子，增加了离子浓度和渗透压。因此在胞外基质中，透明质酸倾向于向外膨胀，产生压力，使结缔组织具有抗压的能力[15]o2．2蛋白聚糖(proteoglycan，PG)它又被称为蛋白多糖，可见于所有结缔组织和细胞外基质及许多细胞表面，是由氨基聚糖与核心蛋I!l(coreprotein)的丝氨酸残基共价连接形成的巨分子。在蛋白聚糖的分子结构中，核心蛋白居于中间，构成一条主链，可有数百个不同的氨基聚糖分子排列在蛋白分子两侧，形成蛋白聚糖单体。若干个单体借连接蛋I!l(1inkerprotein)以非共价键与透明质酸结合形成多聚体‘16]o9 第四军医大学硕士学位论文蛋白聚糖存在于软骨等结缔组织中，构成组织间质。蛋白聚糖约占关节软骨细胞外基质干重的40％。在软骨中100个硫酸角质素及60个硫酸乙配肝素与一个核心蛋白(含2000个氨基酸残基，分子量约3×106)结合，形成蛋白聚糖。约100多个蛋白聚糖分子又通过连接蛋白与透明质酸分子结合，形成一种分子量超过100万的巨大分子，充当软骨的主要成分，使软骨有良好的抗压性和弹性。糖链相互排斥，呈伸展状态，形成高度水合的筛状凝胶¨刀。蛋白聚糖的浓度与胶原的浓度成反比，即蛋白聚糖的浓度随关节软骨深度的增加而升高。硫酸软骨素的浓度也随深度的增加而升高，在辐射区达峰值。硫酸软骨素占蛋白聚糖分子重量的80％一90％，其侧链与水结合，胶原网络抑制蛋白聚糖分子吸水膨胀的趋势，在软骨中这种膨胀被胶原网状结构所限制，最大可能只能达到20％，从而产生膨胀压力。压力可使硫酸软骨素链聚集，以对抗更进一步的压力，同时组织液也被挤出其分子域。随着年龄的增长，硫酸角质蛋白含量增加，而硫酸软骨素的含量减少，关节软骨内水分由75％下降至65％。在特定条件下，蛋白聚糖单体可与胶原结合，一个蛋白聚糖分子可结合30个胶原分子。氨基聚糖及蛋自聚糖可能通过静电力与Ⅱ型胶原相互作用，而定向胶原纤维的排列。此外，细胞表面的蛋白聚糖与纤维粘连蛋白相互作用，为蛋白聚糖和胶原纤维提供了作用点。3．层粘连蛋白和纤粘连蛋白3．1层粘连蛋白(1aminin)它是各种动物的胚胎及成体组织基膜的主要结构组分之一，对基膜基质的组装起关键作用；并可介导细胞粘着于胶原进而铺展，促进细胞生长。Durr进一步证实了软骨细胞能够合成层粘连蛋白，无问质细胞的软骨中有层粘连蛋白存在[183．层粘连蛋白粘附软骨细胞于基质中，稳定了软骨的表型，并调节软骨细胞的分化、生长、增殖及分泌，对软骨的生长发育和代10 第四军医大学硕士学位论文谢发挥有重要作用。3．2纤粘连蛋白(fibronectin)纤粘连蛋白有两种：一种是血浆纤粘连蛋白，另一种是细胞纤粘连蛋白。前者是二聚体，后者是多聚体。二者的功能具有一些细微差异。纤粘连蛋白的主要功能是介导细胞粘着。通过粘着，纤粘连蛋白可以调节细胞的形状和细胞骨架的组织，促进细胞铺展。该蛋白还可以连接肝素和透明质酸钠，它具有软骨细胞外基质其他成分的多个结合位点，对维持胶原纤维网和蛋白聚糖的聚集起重要作用【192们。4．细胞的粘连分子细胞与细胞之间的粘连是由特定的细胞粘连分子介导的，这类分子可以分为两大类，一类需要ca2+参与，另一类则不需要Ca2+参与。许多细胞同时具有依赖于ca2+的和不依赖于Ca2+的粘连分子n53。综上所述，髁状突软骨细胞外基质在软骨组织中起到支持和保护作用，其中胶原赋予组织抗张能力，蛋白多糖为组织的耐压性所必需。正是髁状突软骨细胞外基质成分(尤其是胶原和蛋白聚糖)之间的有机结合和相互作用，才能维持髁状突软骨组织的正常结构，发挥功能。 第四军医大学硕士学位论文第二部分下颌骨牵张成骨对颞下颌关节影响的研究1下颌骨牵张成骨对颞下颌关节影响的实验研究1973年Snyder等Ⅲ1首次将IlizarovGA原理应用于下颌骨DO动物实验，此后的研究主要集中于牵引装置的改进、颞下颌关节组织学观察及临床应用的探讨。近年来，随着动物实验和临床研究的进展，国外学者关于下颌骨DO对颞下颌关节等周围组织影响的研究逐渐增加。如果要全面的分析这些实验研究，首先有必要对这些动物模型有概括性的了解。具体而言，有以下几个主要方面：1．1模型动物至今，已建立的下颌骨DO动物模型主要有6种：1)犬模型【21-24]，2)羊模型[25。271，3)兔模型【28‘3”，4)大鼠模型【32、331，5)猪模型【34351，6)猴模型‘361等。以上模型动物按食性不同可分为四类：啮齿类(鼠、兔)、草食类(山羊)、肉食类(犬)和杂食类(猪、猴)。由于模型动物之间物种、食性及颞下颌关节结构不同，因而它们模拟人类进行实验的相似性也存在差异。其中，兔、鼠的下颌运动是以前后向咬切运动为主，其关节盘前后附着多较长，关节所承受的力主要也为滑动力，垂直方向的压力较小[37J。虽然兔、鼠的价格便宜，来源丰富，但因为其颞下颌关节结构及功能与人类相差太大，实验的模拟性差。山羊的下颌运动是以前后、左右方向为主，关节盘附着松弛，髁状突较小，运动范围较大；在功能过程中，关节所承受的力主要为滑动力，垂直方向的压力很小。犬的下颌运动是以转动运动为主，关节盘附着较紧，运动范围较小，主要为髁状突在关节盘下方作转动运动，关节所承受的力主要为转动挤压力，垂直方向的压力也较小。猪、猴的下颌运动为复合型，颞颌关节兼有铰链运动及滑动运动的特性。在以上动物模型中，杂食类动物的颞下颌关12 第四军医大学硕士学位论文节结构和功能与人类相近，有较好的相似性，最适合DO中颞下颌关节的实验研究。但因为小型猪、猕猴等价格昂贵，无法满足实验需要，所以在实验研究中学者们更多选用犬模型和羊模型。1．2牵张部位和牵张器下颌骨DO按手术和牵张部位不同可大致分为以下五种：①髁状突颈部牵张②下颌骨升支部牵张③下颌角部牵张④下颌骨体部牵张⑤下颌骨颏部中线牵张。不同的牵张部位会影响到牵张器的设计。牵张器可分为口内型和口外型。因为13外型存在钉道感染、面部疤痕、神经损伤以及美观等问题，所以现在的实验和临床研究多采用口内型牵张器。牵张器如果按提供牵引力的支抗来源，又可分为①骨支抗式牵张器，②牙支抗式牵张器【38】，⑨牙一骨支抗式牵张器f391，④牙一种植体支抗式牵张器【40】，其中骨支抗式牵张器比较常用。大多牵张器设计简单，外形为直线或多边形，只能从二维方向上控制DO；而多平面下颌骨牵引器H”的发明弥补了这一缺陷，可以从三维方向上控制DO，避免术后出现前牙开颌、面高增加、}☆关系紊乱等副作用。1．3牵张速率ZouS等啪1研究认为下颌骨牵张过程中，以lmm／d的速率牵张较为理想，速率过快(>2mm／d)会引起颞下颌关节损伤。这与ThurmullerPⅢ1的结论基本一致，他们还建议牵张速率不可大于4mm／d，否则会导致颞下颌关节的不可逆病理改变。Kruse．LoslerB等¨”用不同的实验方法研究发现过大的机械牵张压力(>300，000微应变)会导致兔髁状突软骨各层厚度减少、退行性变和关节炎的发生。另外，HuJ等H21也发现牵引速率过大(≥2mrn／d)会导致下齿槽神经退行性变。根据以往的实验结果，可以推断：在下领骨牵张成骨术中，不会引起下颌周围组织病理改变的最佳牵引速率是1mm／d。13 第四军医大学硕士学位论文以往许多学者选用不同的动物模型，采用常规的牵张速率和方法，来研究下颌DO对颞下颌关节的影响。他们的结论虽不尽相同，但总的可以归纳为两种不同观点。许多学者如McCormickSU‘2”、Karaharju—SuvantoT‘251等分别选用犬下颌角部和羊下颌升支中部进行牵张成骨术，得出一致结论：牵引力可诱发颞下颌关节骨质改变，这些改变是轻微、可逆的。与他们的观点不同，StelnickiEJ“”选用相同的下颌角部进行牵张成骨实验，他却认为下颌骨牵引扩宽可使颞颌关节软骨组织产生非暂时性的负面影响，并建议临床使用牵引扩宽下颌骨技术时必须谨慎。HarperRP等口61则认为颞下颌关节纤维层、软骨或骨软骨交界处出现了形态学变化，变化的严重程度与牵引扩张产生的旋转力有关；并且如果压力超过了生物系统的适应能力，髁状突会产生变性，如原纤维形成、软骨层变薄、直至关节软骨发生退行性变。2下颌骨牵张成骨对颞下颌关节影响的临床观察下颌骨DO已逐渐广泛的应用于下颌发育不良畸形、下颌骨宽度不足、半面萎缩畸形等的临床治疗，成为当今口腔正畸和正颌外科研究的热点之一。其中许多研究已经涉及到了颞下颌关节在下颌骨DO中的变化方面的研究，概括起来，有两种不同观点：McCormick等144J比较了下颌角部骨切开联合DO前后髁状突体积的变化，认为髁状突发生适应性改建，双侧髁状突体积增大，生长相似，而且维持相对对称。而Stucki-McCormickt451、KewittGFl46】并ⅡBrauns【471等则认为颞下颌关节仍然能适应髁状突的位置改变，并未出现临床关节症状，甚至可以明显改善原有的颞下颌关节症状。虽然诸如以上的较多观点支持颞下颌关节在下颌DO中的适应性改建理论，但仍然有部分学者认为下颌DO会对颞下颌关节产生不可逆的负面影响。其中，Grayson等【48】长期临床随访发现下颌骨DO延长后颞下颌关14 第四军医大学硕士学位论文节形态变化长期存在，无恢复趋势，说明下颌DO也可能引起颞下颌关节的永久变化。vanStrijenpJ[49峙艮道了一例15岁男孩在常规的下颌骨DO术后出现髁状突吸收。但是，因为病人颏部曾在固定期受到外伤，并且病人有颞下颌关节病遗传史，所以很难确定下颌髁状突吸收的确切原因。综上所述，国内外学者进行了许多的基础实验和l临床实验的研究，加深了我们对颞下颌关节在DO中变化的了解。为了更深入的揭示下颌牵张成骨对颞下颌关节主要结构的影响，作者选用常规的犬双侧下颌骨牵张成骨模型，采用扫描电镜技术观察髁状突软骨表面结构的超微结构改变，研究髁状突软骨细胞外基质的主要成分(多种胶原蛋白、蛋白聚糖)在下颌骨牵张成骨中的变化规律。15 第四军医大学硕士学位论文实验研究第一部分犬下颌骨牵张成骨中髁状突软骨组织改建的研究自从意大利学者Codivilla[501于1905年首次报道牵张成骨术(DO)以来，关于此项技术的实验和临床研究至今仍在继续。其中，在下颌DO对颞下颌关节的影响这一问题上，国外学者【2425“91持不同意见，国内少见相关报导。本实验采用组织学和扫描电镜(scanningelectronmicroscope，SEM)方法，观察犬双侧下颌骨牵张成骨对髁状突软骨组织结构的影响。1材料与方法1．1动物分组及处理西安本地犬14只(第四军医大学实验动物中心提供)，犬龄4-6月，体重6～8公斤，雄性。观察无明显全身疾患，无牙合关系及牙合运动异常者纳入本实验。动物分为空白对照组、牵张完成后0周组、2周组、4周组、8周组，共5组；其中空白对照组2只，其余每组各实验犬2只，对照犬1只。除空白对照组犬外，所有犬接受骨皮质切开手术。动物用846合剂(兽医大学生产)每公斤体重0．2～0．3ml麻醉。常规消毒、铺巾，在双侧下颌第一恒磨牙的近中邻面行骨皮质切开术，术中置MS一1型内置式下颌骨骨牵引延长器15”。术后经过7天的延迟期后，每天以lmm的速度牵拉实验犬下颌骨，每日2次[313，牵开10mm；对照犬不牵拉。1．2取材及标本处理分别于牵张结束后0、2、4、8周在全麻下用4ml／L。1多聚甲醛缓冲液灌注固定实验犬，每次3只。在空白对照组、牵张完毕后0周组和8周组中，各随机选择两例髁状突(左、右侧均可)备做扫描电镜。其余标本分别仔细剥离关节盘及髁状突，注意避免损伤髁状突表面。继续用4ml／L。16 第四军医大学硕士学位论文多聚甲醛固定24～48h，14mg／L。1EDTA脱钙，经髁状突矢状面分切标本，常规脱水、石蜡包埋、切片，行HE染色，光镜观察。分别用生理盐水和0．2mol／L的磷酸缓冲液冲洗6例髁状突标本数次后，立即将其置入2．5％戊二醛内4。C下固定6周。用不锈钢片将包括髁状突表层软骨及其下骨组织约2mm厚的表层组织切下，留作研究标本。将标本用乙醇逐级脱水，常规COz临界点干燥，离子溅射镀膜(日本电子公司产JFc一100型离子溅射仪)，用JSM一840型扫描电镜(日本电子公司)观察，放大倍数为400倍。2结果2．1犬髁状突光镜观察结果对照组：髁状突软骨组织由浅至深可分为纤维层、增殖层、肥大层和钙化软骨层(见图1)。各对照组的髁状突软骨表面完整光滑，各层带清晰，除8周对照组髁状突中部肥大层占软骨厚度比重增加、骨小梁变得粗大外，各对照组并无明显差异。实验组：牵张结束后0周实验组，髁状突后区的纤维层受损，结构松散，部分纤维层脱落；其他层带连续性较好，变化不明显(见图2)。牵张结束后2周时增殖层细胞数量轻度减少，散在，软骨细胞轻度增生；4周时髁状突中、后端软骨细胞增生更加明显，肥大细胞层增厚。牵张结束后8周时髁状突增殖层细胞增多，软骨层全层仍较对照组和其它实验组厚。2．2犬髁状突扫描电镜(SEM)观察结果对照组：髁状突表面呈凹凸不平的小丘状波纹结构，排列规则，纹宽15um~20um，偶见有纤维条索状结构。髁状突表面覆盖一层细颗粒凝胶样物质，分布均匀(见图3)。镜下可见髁状突表面中央区较平坦光滑，外周细小的波纹状结构。实验组：牵张完成后0周组可见髁状突后区表面高低不平，其中有很17 第四军医大学硕士学位论文多大小不等的小颗粒成点状或团块状分布，波纹状结构仍存，但表面凝胶样物质明显分布不均匀(见图4)；部分区域表现为凝胶样物质减少甚至消失，暴露出胶原纤维，纤维排列紊乱、疏松(见图5)；8周组可见髁状突表面凝胶样物质的分布仍不均匀，部分区域波纹状结构排列紊乱；但大部分区域表面结构基本正常，未见到暴露的纤维(见图6)。3讨论3．1动物模型的建立3．1．1犬的颞下颌关节结构和功能本实验选用犬作为实验动物，是因为犬的下颌关节形态和结构与人类相似，髁状突呈横轴型，关节面由前后两个面相交组成，髁颈缩窄明显。另外，犬属于肉食类动物，下颌运动以转动为主，类似于人类关节的铰链运动，因此实验动物模型与人类有较好的相似性。本实验选用幼年犬，其口颌系统的发育阶段近似相当于人类的混合牙列早期1521，颞下领关节正处于生长发育阶段。在适宜机械力作用下，颞下颌关节组织改建活跃。3．1．2牵张器的选用和牵引方式因为口外延长装置会造成皮肤疤痕而影响美观，不利于临床推广，所以本实验选用内置式下颌骨牵张器。而选择旖行双侧下颌骨体部的牵引术，是为开展下颌骨发育不良畸形的临床治疗提供理论依据。3．2髁状突软骨在颞下颌关节改建中的意义国外学者一直把髁状突软骨组织作为研究颞下颌关节改建的重点，以往的研究多集中在增殖层和软骨增长等方面[5330自关节面向深部，髁状突软骨可分为纤维层、增殖层、肥大层和钙化软骨层。其中增殖层内细胞代谢较浅表区内活跃，均具有细胞内结构，如内质网、线粒体和高尔基复合体。基质内的胶原纤维粗大，与关节面呈斜形排列，该层内的蛋白聚糖也较易分离。而肥大层是髁状突软骨中最厚的部分，软骨细胞呈柱状排列，18 第四军医大学硕士学位论文胶原纤维垂直排列，部分穿过潮线和钙化软骨达软骨下骨层，使髁状突软骨牢固地附着在骨上。胶原与蛋白聚糖紧密相联，但也有许多单体存在，难以检测到连接蛋白的存在。在透明质酸支架上有大量的蛋白聚糖聚合物存在。此区内胶原纤维直径最粗，可能与它们需要抵抗蛋白聚糖膨胀性的压力有关。髁状突软骨分层排列反映了髁状突软骨功能适应的生物力学变化。浅表层主要以剪力为主；过渡区和辐射区则主要承受压力载荷；钙化软骨将关节面附着于骨上。髁状突软骨关节面比纤维性关节能耐受较高的生物学压力。髁状突软骨的基质由包埋在蛋白聚糖及水组成的胶体中的胶原纤维网组成；胶体抵抗压力，胶原纤维抵抗张力，使胶体在受压时只产生有限的移位。髁状突软骨对颞下颌关节的生长和改建起重要作用，增殖带细胞对生物机械压力改变的反应能力决定着改建活动””。3．3下颌骨牵张成骨对髁状突软骨改建的影响以往学者选用不同的动物模型来研究DO对颞下颌关节的影响。McCormick等口4】利用蒙古犬进行下颌角部骨切开DO。组织学观察发现，髁状突后面变平，软骨层变薄，其下方可见骨细胞增殖和骨唇形成，未见坏死和退行性变。他们认为牵引力可诱发关节骨质改变，这些改变是轻微的、可逆的。ZouS瞳73单侧牵引羊下颌体部，发现每天以lmm的速度牵拉下颌骨，双侧髁状突会出现适应性的改建，软骨层增厚，肥大细胞增多，并且在钙化软骨深层有明显的新骨生成。可以推论，尽管由于牵张的部位和牵张的方向不同，引起颞下颌关节变化的机理有所不同；但是在适宜的牵引频率和速度下，这些改建过程都没有出现严重的组织破坏，而出现以髁状突软骨细胞增殖和软骨成骨增加为主的改建反应。但本实验结果与以上研究结果不尽相同。本实验组织学观察结果发现髁状突在下颌DO初期，由于牵张外力作用的影响，局部组织出现异常改19 第四军医大学硕士学位论文变，纤维层受损，扫描电镜观察可见凝胶样物质减少、消失，甚至暴露出下层胶原纤维；但后期髁状突出现适应性改建，组织结构、尤其表面结构基本恢复正常。在本实验中，多例髁状突标本出现了类似于退行性变的暂时性反应，而且比一些研究结果更加严重，分析原因，可能有以下几种：①动物模型不同。本实验采用的是杂种犬，它具有铰链型的下颌关节结构，并且颞下颌关节韧带和周围肌肉相当粗大、发达，在DO中可能会对盘一突复合体产生过强的拉力或压力；②实验所使用的牵张器不同。不同材料、不同结构和不同的加载负荷对颞下颌关节的影响是不同的。⑧牵引延长的距离不同。牵开的距离越大，周围组织所受的影响自然越明显。本实验的犬双侧下颌骨各牵开lOmm，牵开的距离较大。④牵引延长的方向不同。本实验对下颌骨施行双侧牵引，牵张方向与黔平面平行；但下颌骨的“v”字形结构必然会使影响牵引力的直线传导，也因此会导致髁状突不同部位发生不同改变。本实验发现髁状突的后上外部比其他部位组织学改变明显。⑤Do引起的咬合干扰。因为咬合干扰在不同的DO实验中严重程度不同，所以它对颞下颌关节的影响也可能是不同的。虽然以往的动物实验研究很少考虑到咬合因素的影响，但作者认为在下颌骨牵张延长时，不可避免的会产生个别或多个牙的暂时性的早接触和咬合干扰。在本实验中，作者曾考虑过采用调骀或制作骀垫的方法来减轻咬合因素的影响，但因为实验操作中多方面的限制，最终只是依照HollisBJb51的方法，少量调磨犬下颌乳尖牙的牙尖来减轻咬合干扰。 第四军医大学硕士学位论文第二部分犬下颌骨牵张成骨中髁状突软骨I、Ⅲ型胶原变化的研究以往关于DO对颞下颌关节影响的研究较多局限于关节软骨组织学结构的变化，结论不～，而对于髁状突软骨细胞外基质成分变化的研究甚少。另外，许多学者认为I、IIl型胶原作为髁状突软骨细胞外基质的组成成分，能够客观地反映髁状突的改建和损伤。本实验采用免疫组织化学的方法，旨在观察下颌骨牵张成骨中犬髁状突软骨I、III型胶原表达的改变，进一步探讨下颌DO对颞下颌关节改建的影响。1材料与方法1．1动物分组及处理(见第一部分)1．2取材及标本处理(见第一部分)1．3免疫组化染色I、ⅡI型胶原单克隆抗体和sABC试剂盒均购自Boster公司，染色过程同常规：(1)石蜡切片脱蜡至水；(2)3％过氧化氢室温孵育10分钟；(3)蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟；(4)0．05％胰蛋白酶3TC消化20分钟；(5)PBS浸泡3次，每次5分钟；(6)10％正常山羊血清封闭，室温孵育10分钟；(7)倾去血清，滴加适当比例稀释的一抗，III型胶原抗体的工作浓度为1：100，37。C孵育60分钟；(8)PBS冲洗3次，每次5分钟；(9)滴加适当比例稀释的生物素标记二抗，3TC孵育30分钟；00)PBS冲洗3次，每次5分钟；OD滴加适当比例稀释的辣根酶标记链酶卵白素，37℃孵育30分钟：∞PBS冲洗3次，每次5分钟；⑩DAB显色，自来水冲洗，复染，封片。用PBS分别代替两种抗体作为阴性对照。1．4结果判定及处理镜下观察组织中出现明确的棕色反应时即判断为阳性。每张切片随机2l 第四军医大学硕士学位论文选取5个400倍视野，用5mmX5mm网格目测微尺观察，记录阳性细胞数并计算其占总计数细胞的百分比，并根据百分比将反应强度分为4个等级：无阳性细胞(一)；阳性细胞<25％(+)；阳性细胞占25％～50％(}})；阳性细胞>50％(卅)。同时参考染色的灰度强弱分析实验结果。2结果2．1犬髁状突软骨细胞I型胶原的变化对照组：髁状突软骨4层中均有I型胶原的分布，从表及里表达逐渐减少，钙化软骨层深层也有少量阳性细胞(+)。各对照组间染色结果未见明显差异(见图7)。0周实验组：髁状突上、后部表面受损，结构松散，部分纤维层脱落。纤维层、增殖层细胞的胞浆及胞膜有浅棕色染色，肥大层和钙化软骨层也有少量细胞阳性染色。2、4周实验组：髁状突中、后部肥大层明显增厚，I型胶原阳性细胞数增加，散在分布(+)(见图8)。其余各层染色未见明显变化，仍有浅棕色染色的弱阳性细胞。8周实验组：髁状突软骨层较厚，纤维层、增殖层细胞的胞浆及胞膜有淡棕色染色：髁状突后部肥大层细胞呈棕黄色，阳性细胞数量增加(+1，钙化软骨层也有细胞呈棕色染色(见图9)。2．2犬髁状突软骨细胞III型胶原的变化对照组：1Il型胶原在犬髁状突软骨组织中有少量表达，主要分布在肥大层浅层软骨细胞的胞浆及胞膜上，染色为浅棕色(见图10)。其中，III型胶原在8周对照组髁状突软骨肥大层的染色比在其他对照组染色弱，而且阳性细胞数量明显减少。0周实验组：III型胶原在肥大层浅层软骨细胞的胞浆及胞膜有浅棕色阳性表达，阳性细胞数量较少(+)。其他层胶原表达不明显。 第四军医大学硕士学位论文2周实验组：III型胶原分布于肥大层浅层和中层软骨细胞的胞浆及胞膜，浅棕色阳性表达，阳性细胞数量仍较少(+)。其他层细胞染色情况与O周实验组相似。4周实验组：髁状突增殖层细胞增多，肥大细胞层增厚，细胞肥大，出现软骨细胞群，软骨下骨组织髓腔增大，充血。3／4髁状突标本上、后部的肥大层大部和钙化软骨层部分细胞的胞浆呈深棕色，阳性细胞数明显增加({{)；1／4标本III型胶原呈弱阳性表达(见图11)。8周实验组：肥大层软骨细胞的胞浆中III型胶原表达减弱，阳性细胞数减少，分布不均(+)。髁状突软骨其余层染色变浅。见图(见图12)。在本实验中，III型胶原在纤维层和增殖层表达不明显，而且I、III型胶原表达的变化主要集中在肥大层，所以本实验仅对实验组犬髁状突矢状面不同部位的肥大层细胞进行测量计数并比较，结果用直条图表示如下： 第四军医大学硕士学位论文llI型胶原阳性细胞率随时间变化图3讨论3．1IIl型胶原在髁状突改建中的意义正常的成熟髁状突骨上组织无m型胶原表达[563III型胶原由成纤维细胞产生，常共同分布于间质结缔组织中。但IlI型胶原构成的结缔组织疏松，易膨胀、受损和撕裂，在新生稚嫩组织(如胚胎和早期疤痕组织)中含量丰富。当组织炎症或创伤修复时，III型胶原是早期修复中合成的主要胶原蛋白形式，以后逐渐为I型胶原所替代。III型胶原不仅存在于纤维修复组织中，亦可存在于髁状突软骨的修复部位[5730因此III型胶原可作为反映髁状突损伤和改建程度的一个客观指标【58J。本研究观察到对照组In型胶原在髁状突骨上组织中有少量表达，主要分布在肥大层浅层软骨细胞的胞浆及胞膜上。其原因可能是生长期犬髁状突软骨增殖层的未分化细胞正逐渐分化为深层的软骨细胞，后者不完全成熟，故有III型胶原的表达。实验组动物由于下颌DO造成髁状突的负荷增加，髁状突软骨发生改建，不断有新生的软骨细胞生成，表达胶原类型发生转变，导致III型胶原的表达增加。4周实验组髁状突肥大层大部和钙化软骨层细胞的强阳性染色，说明髁状突软骨的改建活动正处在最活跃时期， 第四军医大学硕士学位论文软骨的修复能力已达到高峰。III型胶原在髁状突骨上组织的不同时间不同程度的表达，可以提示髁状突在下颌DO中经历了一个适应性改建的过程。而III型胶原在8周实验组仍有高于正常水平的表达，又说明这个改建过程需要维持较长时间。3．2I型胶原与III型胶原在髁状突改建中的关系及其意义一般透明软骨只存在II型胶原，而髁状突软骨同时含有几种胶原，这是与颞下颌关节纤维软骨的特性有关【59】。髁状突在对外来应力的反应中，软骨细胞合成II型胶原的能力下降，表达胶原类型发生转变，细胞出现反分化，产生I型胶原【60】，求得自身保护，抵抗外界的压力，本实验的结果也证实了这一点。增强表达的I型胶原，短期内是对机体的保护，同时使软骨失去原有弹性。本实验中后期I型胶原表达量的增加，说明软骨细胞在后期进行自我代偿，是髁状突软骨组织的胶原分泌发生改变，以维持颞下颌关节相对正常的功能。犬髁状突软骨仍然有局部组织的纤维化现象，并且将会持续很长时间。这提示我们在临床治疗中应该密切关注颞下颌关节组织的变化，防止不良外力的影响，给髁状突适应性改建活动提供良好的外在条件。 第四军医大学硕士学位论文第三部分犬下颌骨牵张成骨中髁状突软骨细胞外基质中胶原蛋白和蛋白聚糖变化的研究髁状突软骨细胞外基质在维持髁状突的正常功能和组织改建中发挥着重要的作用，但在下颌DO中这些基质成分究竟如何变化，至今未见相关报道。本实验采用组织化学方法，研究犬双侧下颌DO对髁状突软骨细胞外基质的影响，揭示髁状突软骨细胞外基质主要成分的变化规律，进一步探讨下颌DO对颞下颌关节改建影响的机理。1材料与方法1．1动物分组及处理(见第一部分)1．2标本的处理及观察分别于牵张结束后0、2、4、8周在全麻下用4ml／L1多聚甲醛缓冲液灌注固定实验犬，每次3只。分离双侧颞颌关节后，继续用4ml／L。多聚甲醛固定24～48h，14mg／L。1EDTA脱钙，经髁状突矢状面分切标本，常规脱水、石蜡包埋、切片。用下述2种方法分别做组织化学染色：(1)VanGieson苦味酸酸性复红法：胶原纤维呈红色；(2)阿辛蓝／中性红染色法：蛋白聚糖呈蓝色‘6¨。2结果2．1对照组犬髁状突软骨组织化学观察髁状突软骨各层均有红色染色，并且在纤维层、肥大层的染色较深(见图13)；而蛋白聚糖染色较多的集中在肥大层，呈蓝色(见图14)。各对照组问染色未见明显差异。2．2实验组犬髁状突软骨组织化学观察：在牵张完成0周组中，髁状突后部表面受损，结构松散，部分纤维层 第四军医大学硕士学位论文脱落。肥大层、钙化软骨层胶原和蛋白聚糖染色均有阳性染色。随着增殖层和肥大层软骨细胞代偿性的增加，胶原和蛋白聚糖染色的强度均明显减弱。4周组犬髁状突软骨中、后部纤维层、肥大层和钙化软骨层两种染色轻淡，分布不均；其中，胶原呈淡红色(见图15)；蛋白聚糖染色变浅，蓝染区域减少(见图16)。8周组犬髁状突软骨纤维层肥大层、钙化软骨层胶原和蛋白聚糖染色均明显加深。3讨论3．1软骨细胞外基质在研究髁状突改建中的意义髁状突软骨组织由软骨细胞和软骨细胞外基质组成，软骨细胞分泌基质。基质中各不同方向的胶原纤维组成无数个“网状拱形结构”；而软骨表面胶原纤维则平行于骨呈切线方向走行，形成“薄壳结构”。软骨细胞外基质保护软骨细胞并维持髁状突软骨正常结构及功能。髁状突软骨受伤后，基质中胶原纤维组成的“拱形结构”破坏，承重时不能向周围传递压力，则压力不能分散，局部压强增大，结果改变了软骨正常压力分布，造成软骨细胞受到过大压力。同时，生理性压力改变、基质破坏后失去正常弹性，软骨营养障碍，出现软骨细胞退性行变、坏死，软骨细胞受损后不能再分泌产生胶原纤维使软骨进一步破坏哺∞。这一理论阐述了软骨受伤后，其胶原网架结构首先受到损伤，发生断裂，然后软骨细胞由于失去网架结构的保护而出现变性、坏死的骨关节病病理发展过程。髁状突软骨具有相当水平抵抗外来应力的能力，在很大程度上归因于软骨细胞外基质。3．2胶原蛋白和蛋白聚糖在髁状突改建中的意义胶原蛋白和蛋白聚糖是软骨细胞外基质的主要有机成分。其中髁状突软骨的胶原纤维主要是II型胶原，同时和I型、III型等其它类型的胶原并存。蛋白聚糖是软骨细胞外基质的重要组成成分。蛋白聚糖中的多糖链为杂多糖，因其组成成分中均含氨基已糖，所以称为氨基多糖或糖胺多糖27 第四军医大学硕士学位论文(glycosaminoglycan)。各种糖胺多糖除透明质酸外都含硫酸，因而糖胺多糖为酸性；再加上其分子大而且有粘性，故又称为酸性粘多糖(acidmtlcopolysaccharide，AMPS)。髁状突的蛋白聚糖主要集中在深层的软骨细胞周围f63Jo蛋白聚糖分子包裹在胶原网隙内，带有高度的负电极团，在基质问隙液和滑液间产生很高的渗透压力梯度，使软骨细胞外基质具有极强的亲水性并因此产生液体膨胀压，维持胶原网以至髁状突软骨构架的动态平衡。软骨细胞外基质内部形成的这种胶原一蛋白聚糖一水凝胶网架结构体系，保证了髁状突软骨具有承载、应力分散、应力缓冲以及关节润滑的功能。任何外源性或内源性因素造成网架体系的破坏，都将引起软骨结构代谢和功能的改变，导致关节病变的发生Ⅲ1。在VanGieson法染色中，由于胶原纤维存在羟化的前n．多肽链，与酸性染料结合被染成红色[65)o虽然在实验组中软骨胶原染色并未出现较大差异的变化，但仍然可见其逐渐减弱的趋势。可以推论，髁状突软骨为适应外来应力，软骨细胞合成胶原(尤其是II型胶原)的能力下降。在软骨细胞增多的区域，胶原纤维染色灰度明显减弱，其原因可能在于，这些细胞属于新生的软骨细胞，仍未到DNA合成的旺盛期。阿辛蓝染色可以显示软骨细胞外基质中的酸性粘多糖。本实验中染色显示牵张结束早期酸性粘多糖的含量明显减少，8周后又逐渐增加，表明下颌DO导致了髁状突软骨蛋白聚糖合成的改变。从关节软骨生物力学的二相理论来考虑，关节软骨在压力作用下，允许大部分间质液自由移动，关节软骨内部产生肿胀膨胀压力，这个压力由胶原网来对抗，外部压力增加，内部的膨胀压力也增加。在下颌DO过程中，髁状突软骨通过蛋白聚糖的合成，减少液体的流动和减小组织的变形，以对抗增加的外部压力，一直达到与外部压力平衡[66]o本实验通过双侧下颌骨DO中髁状突的组织化学染色显示：随着时间28 第四军医大学硕士学位论文的延长，髁状突增殖层和肥大层软骨细胞代偿性的增加，染色的强度均明显减弱。在维持较长时问后，软骨的肥大层细胞层和钙化层的基质染色又逐渐加深。其中，在牵张结束后4周时，犬髁状突软骨区胶原总量和蛋白聚糖含量减少，特别是酸性粘多糖减少。可能存在基质合成减少，或者是基质的分解破坏或者转化，其确切的机理尚需进一步研究证实。而在牵张结束后8周，犬髁状突软骨组织化学染色加深，蛋白聚糖逐渐增多，基质含量增加。这是软骨组织的一种代偿性反应，可能是因为DO产生的关节区的负荷刺激了软骨细胞，继发的引起软骨组织对基质的分泌和合成增加来改建软骨改变区，建立新的结构平衡以维持关节的正常功能。 第四军医大学硕士学位论文全文总结本实验以14只替牙列期杂种犬为研究对象，设立实验组和对照组，建立犬双侧下颌体牵张成骨动物模型；采用扫描电镜、组织化学和免疫组化等方法，观察犬下颌骨牵张成骨中髁状突软骨组织学和细胞外基质的变化，探讨下颌骨牵张成骨对髁状突的影响。结果如下：1．组织学观察结果显示：实验组犬在牵张结束早期髁状突后区表面的凝胶样物质减少、消失，甚至会暴露出下面疏松的、排列紊乱的胶原纤维组织。牵张结束8周后髁状突表面结构明显恢复，接近正常。2．免疫组化结果显示：实验组犬髁状突III型胶原的表达随时间的延长逐渐增加，至牵张结束4周达到顶峰，牵张结束8周时表达接近正常：而I型胶原在牵张结束8周时仍有较高水平的表达。3．组织化学观察结果显示：犬在牵张结束后，髁状突软骨总胶原蛋白和蛋白聚糖的含量均降低，尤以髁状突后区最明显。牵张结束8周后两者的含量逐渐增加。本研究结果提示：在犬双侧下颌骨牵张成骨术中，髁状突软骨经历了一个组织改变和趋向恢复的改建过程，其中包括组织学改建、胶原和蛋白聚糖含量的改变等，显示髁状突有很强的改建能力。在常用的牵张速率和时间等条件下，髁状突组织发生适应性改建，建立新的平衡以维持其相对正常功能。有关犬下颌骨牵张成骨对颞下颌关节其他组织(如关节盘、关节窝、关节韧带等)的影响尚有待进一步研究。30 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第四军医大学硕士学位论文致谢值此论文完成之际，首先我要衷心感谢我的导师丁寅教授，感谢他在科研和临床工作中给予的悉心关怀、严格要求和无私指导。他一丝不苟的工作作风，认真严谨的治学态度，高尚敬业的医德医风深深影响着我，我的每一点的进步都凝结着导师的心血，在此对他辛勤的劳动表示衷心的感谢和崇高的敬意。感谢正畸科林珠教授、段银钟教授、邵金陵副教授、王海雪护士长等在学习期间给予的热心帮助。感谢正畸科所有医护人员三年来对我的热情关怀和支持。感谢夏春鹏硕士、李菲菲硕士在动物实验中的共同协作。感谢口腔医院病理科李媛技师、张光东博士、高全文硕士以及校电镜室的李向党老师、兰州军区二一三所电镜实验室强永刚和安琪老师的指导和热情帮助。感谢口腔医院放射科王艳清老师的热情帮助。感谢党平硕士、曾真硕士、叶虎硕士、任广立硕士、王亚周硕士等在这三年的学习和生活中对我的体贴和照顾。感谢所有关心、指导和帮助过我的老师、同事和同学。38 第四军医大学硕士学位论文个人简历张春光，男，安徽濉溪人，1977年3月出生1994．8．1999．7山东医科大学口腔医学系本科生1999．8—2000．8安徽省淮北市人民医院五官科医师2000．9．2003．6第四军医大学口腔医学院正畸科硕士生发表论文1．张春光，丁寅等．下颌骨牵张成骨中髁突软骨基质的组织化学研究．临床口腔医学杂志．2003；19(3)：140-142．2．张春光，丁寅等．下颌骨牵张成骨髁突软骨III型胶原的免疫组化研究．第四军医大学学报(待发表)39 第四军医大学硕士学位论文附图 ——釜塑茎垦叁兰坠!：垒墨———————————一一l对照缀犬嫌建软骨缀织学绪梅(VlE×j0)2瘁张豁束奇街纽穴1嫌突中晶部轩维蹉结构受撷{HEx10)3对照维犬髁突表龋呈波纹状铭年q‘s曲^x4∞)4前j张龋柬0脚组犬髁突后区表面(SEM×400)5‘牵张结束0周盟i犬髑突1|罾区局郏表逝胶原纤维暴蓐，排列紊乱(SEMX400)6．枣张结柬8周组犬髁突蜃遁表赠结掏已基本攘复正常(SEM×400)7．对照缎犬躲窘I型腔原染色(SABCX20}8‘牵张结束4捌攫犬鳃突l型腔敞染色(SABCX20' 蔓墨兰曼盔鲎塑!：笙兰一望牵张结粜4髑缒犬撵突l犁羧臻染色(SABC×40)lO对照绑犬鳃突ffI型腔藤染色(SABC)(40)lI，牵张结柬4周姐犬魏突|||型骏鳆染毪(SABCx40)12．乖张结柬8周擅犬辣突Ill型胶棘染色(SABCX40)13。对照组武骤突VanGiesan法染色(×20)14．对照缎犬棵突阿睾蓝染色(×20)15．牵张结柬4闺组犬辣突VanOiesoa法染熟(×20)掩本{铤结柬4糖维欠酥突蕊辛蓝染色(×20)