细胞周期和细胞凋亡的影响-张元新

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1、第32卷第5期长春师范学院学报（自然科学版）2013年10月Vol.32No.5JournalofChangchunNormalUniversity(NaturalScience)Oct.2013吴茱萸碱对SGC－7901细胞周期和细胞凋亡的影响张元新，葛雅琨(吉林化工学院化工与生物技术学院，吉林省吉林市132022)［摘要］本文研究吴茱萸碱对胃癌细胞SGC－7901凋亡的影响，用不同浓度的吴茱萸碱处理SGC－7901细胞，采用MTT法评价吴茱萸碱对SGC－7901细胞增殖的影响;用流式细胞术检测吴茱萸碱对SGC－7901细胞周期和细胞凋亡的影响;Western－blo

2、t检测其对caspase－3的表达影响。结果表明吴茱萸碱激活了caspase－3，引起明显的SGC－7901细胞G2/M期阻滞和凋亡。［关键词］吴茱萸碱;细胞周期;细胞凋亡;胃癌［中图分类号］Q732［文献标识码］A［文章编号］1008－178X(2013)05－0071－04［1］吴茱萸是芸香科植物吴茱萸、石虎及梳毛吴茱萸成熟的果实。吴茱萸碱(Evodiamine，Evo)是从吴茱萸中提取出的主要活性生物碱之一，其分子式为C19H17N3O。近年来的研究表明吴茱萸碱对多种肿瘤细胞，［2］［3］［4］［5］［6］［7］［8］如肾癌细胞、前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤，宫颈癌

3、，胃癌，结肠癌等具有抑制作用。［9］胃癌是世界上最常见的癌症之一，仅次于肺癌，位居第二，每年全球大约有800，000人死于此病。其中大约有三分之二的新生病例和死亡病例是发生在欠发达国家和地区。日本、中国、韩国、中南美洲、东欧以及［10－11］中东部分地区是胃癌的高发区;而北美、澳大利亚、新西兰、北欧和印度的发病率较低。胃癌患者的五年的生存率不足20%。对于那些早期诊断的患者，应用内窥镜粘膜切除术(Endoscopicmucosalresection，EMＲ)可以对其进行治疗;目前这种外科手术的方式也只能治愈不到40%的病例，大多数胃癌都发生了转移，最后只能依靠辅助化疗的

4、方式对其进行治疗。对晚期和复发的患者，化疗成了主要治疗手段。因此，高效、低毒并具有新作用机制的抗肿瘤药物的研究迫在眉睫。本研究探讨了吴茱萸碱诱导胃癌细胞SGC－7901的凋亡作用及其机制。1材料与方法1．1主要试剂吴茱萸碱(Evodiamine)购自SIGMA公司。Anti－Caspase3、β－actin抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG抗体均购自SantaCruz公司;新生牛血清、DMEM培养基购自Gibco公司;PVDF膜(0．22μm)，Millipore公司;预染蛋白Marker，购自Fermentas公司。Anne

5、xinV－FITC/PI凋亡检测试剂盒，BD公司。1．2细胞培养人胃癌细胞系SGC－7901细胞购自中国科学院细胞库。SGC－7901细胞用含10%的新生牛血清的DMEM培养基，5%CO2、37℃、饱和湿度的恒温孵育箱培养。1．3MTT实验3将对数生长期的细胞SGC－7901以5×10个/孔浓度接种于96孔板中培养过夜。用吴茱萸碱(0.000001～100μM)处理SGC－7901细胞48h。每个浓度3个复孔，并设空白对照和阴性对照孔。细胞加药处理后的时间点，分别加入5mg/ml的MTT20μL，37℃继续孵育4h。轻轻吸去孔内的培养基，每孔加入［收稿日期］2013－0

6、6－05［作者简介］张元新(1978－)，男，辽宁建昌人，吉林化工学院化工与生物技术学院讲师，博士，从事天然药物与肿瘤研究。［通讯作者］葛雅琨(1977－)，女，辽宁建昌人，吉林化工学院化工与生物技术学院讲师，博士，从事小分子化合物与肿瘤研究。·71·150μl的二甲基亚砜(DMSO)。在酶标仪中震板10min，测定490nm的光吸收值。计算存活率和抑制率，公式如下:存活率=实验组OD平均值/对照组OD平均值×100%．抑制率=(对照组OD平均值－实验组OD平均值)/对照组OD平均值×100%．1．4细胞凋亡与细胞周期将对数生长的细胞以每孔4×105个接种于六孔板中，贴

7、壁培养过夜后，按照设计的不同药物浓度(0.01～100μM)处理细胞。在药物的作用时间点，把细胞培养液吸出至一个合适的离心管内，PBS洗涤贴壁细胞一次，加入适量的胰酶消化细胞，37℃孵育2min，用含血清的培养基终止消化，轻轻吹打细胞，合并在同一离心管中，但避免胰酶的过度消化。1500rpm，离心3min，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。1500rpm，离心3min，弃上清，用1×LoadingBuffer将细胞配成浓度为106的细胞悬液。取100μl细胞悬液分别依次加入5μlAnnexinⅤ－FITC和5μlPI，轻轻混匀