细胞周期和细胞凋亡课件.ppt

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1、细胞周期和细胞凋亡技术第一节细胞增殖周期一、细胞周期概述细胞周期:细胞从一次分裂结束开始到下一次分裂结束为止所经历的过程G1SG2M细胞周期G1期（DNA合成前期）S期（DNA合成期）G２期（DNA合成后期）有丝分裂期（M期）间期前期中期后期末期G1SG2MTc=TG1+TS+TG2+TMG1D(分化态)G1AG1BG1A态:染色质螺旋化程度较高，RNA含量较少G1B态:染色质螺旋化程度较低，RNA含量较多G1SG2MG0(静止态)G1TG1TS0STSTG20G2TG2T细胞周期室:二、细胞周

2、期各时相的特点(一)G1期限制点(R点):在G1期存在一个调节细胞周期的开或关的“阀门”，即限制点（亦称为检验点）。（控制细胞从G1A态转为G1B态的临界点）RG20G1DG1AG1BG0SG2MS0G1１.G1期细胞的生长合成三种RNA核糖体的组装结构蛋白酶蛋白的合成ＮＰ＝（核质比）细胞核体积细胞质体积＝ＶnVc－Vn＝0.3~0.52.G1期细胞的增殖状态G1期细胞类型增殖细胞群暂不增殖细胞群(保持着增殖能力但处于休止状态）永不增殖细胞群G1D永不增殖细胞群G０暂不增殖细胞群增殖细胞群死亡(

3、二)S期:合成DNA(三)G2期:为M期的细胞分裂作好物质和能量贮备(四)M期把复制好的染色体平均地分到两个子细胞中去二.细胞增殖与肿瘤肿瘤的群体类型增殖细胞群(A)暂不增殖细胞群(B)不再增殖细胞群(C)衡量一个肿瘤细胞群体的增殖速率的动力学参数主要为:肿瘤的生长分数GF=(增殖率)增殖细胞数肿瘤群体细胞总数=AA+B+C第二节细胞凋亡技术细胞凋亡（apoptosis）多细胞有机体为调控机体发育，维护内环境稳定，由基因控制的细胞主动死亡过程。又称为程序性死亡（programmedcelldea

4、th,PCD）一.细胞凋亡的特征形态学特征：细胞膜向外突起，细胞体积缩小↓染色质凝缩，然后断裂成碎片↓形成数个大小不等的由膜包裹的凋亡小体↓凋亡小体被邻近细胞吞噬（2）细胞坏死（necrosis）概念：细胞受到激烈的物理、化学刺激或严重的病理性刺激后，引起的细胞损伤和死亡。特征：胞膜通透性增高，使细胞肿胀，细胞器变形或肿大，细胞核破碎，最后细胞溶解破裂，溶酶体泄漏，引起炎症反应。细胞凋亡与坏死的区别特征细胞凋亡细胞坏死细胞形状细胞皱缩细胞肿胀、溶解膜的完整性能保持不能保持细胞器结构完整肿胀、破裂

5、染色质浓缩分解细胞核生化改变DNA片段化弥漫性降解特性推荐使用手段说明形态学细胞表面改变扫描电镜微绒毛消失,芽状突起,可见凋亡小体胞浆改变相差显微镜细胞皱缩,质膜变形,胞浆空泡染色质凝聚核裂解相差显微镜或光镜适用于组织切片荧光显微镜用结合DNA的染料标记,适用于培养细胞流式细胞仪定量测定DNA含量,细胞的大小和蛋白,适于培养细胞超微结构透射电镜完整的细胞器,胞浆空泡,核染色质凝聚裂解,凋亡小体适用于组织切片或培养细胞生化改变DNA裂解琼脂糖凝胶电泳梯状条带磁场反转凝胶电泳可测50bp或300bp

6、的HMW片段TUNEL法原位缺口平移法基因表达可从mRNA、蛋白层次测定，可用免疫组化、原位杂交、Northern印迹法等二、细胞凋亡的检测方法1、透射电镜形态学观察法收集细胞→PBS洗两遍→戊二醛固定→电镜切片形态特点：细胞膜起泡、出芽，染色体凝集，形成的凋亡小体。缺点：①只能定性不能定量②标本处理过程复杂、设备昂贵，不适合作大批标本检测2、扫描电镜形态学观察法主要观察细胞表面的结构变化凋亡的肝癌细胞表面微绒毛消失凋亡细胞表面有众多凋亡小体正常的肝癌细胞3、流式细胞分析仪（FlowCytome

7、try，FCM）流式细胞仪是将流体喷射技术、激光技术、空气计数、γ-射线能谱术及电子计算机等技术与显微荧光光度计结合的一种大型的精密仪器，它通过测量在一定波长的激光激发快速流动的粒子（细胞或微粒）荧光和散射激光来获得粒子的一些成分及其变化情况，进行多参数的、快速的定量分析和分选的技术。FCM应用标志着细胞学、肿瘤学、免疫学等进入了细胞和分子水平的研究。概念：流式细胞仪与显微镜FLOWMICROSCOPE光源激光自然光、灯光、氙(汞)灯对象细胞、生物粒子细胞、生物粒子承载工具载(盖)玻片*鞘液及流

8、动室检测信号光学信号形态及染色放大方式PMT，放大电路目镜X物镜,光学放大统计人工，200计算机，>5000结果简单，单参数多参数，综合分析注:鞘液是指无细胞的磷酸缓冲液基本原理待测单细胞悬液细胞（染色后）→压入流动室→鞘液在高压下从鞘液管喷出→鞘液包绕着样品高速流动，使细胞排列成较稳定的单细胞队列→激光垂直照射在样品流上，使被染色的细胞在激光束的照射下产生散射光和激发荧光→散射光和荧光分别被光电二极管和光电倍增管接收→转换成电压脉冲和积分脉冲→信号经模-数转换后进入计算机利用特殊的荧光染料(P