细胞凋亡、细胞周期.pdf

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1、BD流式系列课堂-1：研究细胞生命活动的流式解决方案细胞凋亡概述•又称为程序性细胞死亡(ProgrammedCellDeath)是机体主动的、高度有序地清除无用细胞的过程。和细胞坏死(Necrosis)相区别，坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。薄膜有小泡状形成细胞凋亡与疾病的关系3细胞凋亡事件发生表细胞膜事件线粒体事件Caspase事件细胞核事件1.细胞膜变化的检测：AnnexinV/PI磷脂酰丝氨酸(PS)的检测：早期凋亡早期凋亡PS检测及结果判定早期凋亡特征：•磷脂膜(PS)外翻，但是细胞膜保持完整性，因此PI染色为阴性•DNA没有发

2、生断裂早期凋亡PS检测及结果判定PIAnnexinV-FITC细胞膜变化的检测：AnnexinV/PI优点：简便、快速、准确区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞样本设置：1.空白对照：辅助判断管，即不加AnnexinV/PI，但用它调电压的话，电压偏高，即根据它确定的阴阳性界限是偏低的。2.阴性对照：未诱导的，AnnexinV/PI双染，细胞绝大部分都在双阴性区域，用它来确定两荧光通道的电压，这是为了排除非特异性结合。3.单阳样本：诱导凋亡，AnnexinV单染，用来调补偿4.单阳样本：诱导凋亡，PI单染，用来调补偿注意事项：1.细胞制备或储存时细胞膜损伤，造成假阳性2.贴

3、壁细胞消化时避免使用EDTA，螯合钙离子BDAnnexinV流式检测试剂盒KitCatno.AnnexinV:FITCApoptosisDetectionKitI556547AnnexinV:FITCApoptosisDetectionKit556570II-Containsunlabeledrecomb.AnnexinVAnnexinV:PEApoptosisDetectionKitI559763提供FITC,PE,APC,CY5,CY5.5,BDHorizonV450,BDHorizonV500等多种荧光标记的AnnexinV以及纯净的AnnexinV。Annex

4、inV检测常见问题1.是否AnnexinVKits可以检测小鼠或其他物种?•AnnexinV试剂盒可以检测多种属2.这个试剂盒是否可用于贴壁细胞、固定或冻存的细胞、或组织?•No.上述样本的细胞细胞膜都会或多或少受到损害，这样的样本建议用免疫荧光技术(Cat.No.550911)3.是否与细胞表面标记兼容?CD11B/MAC-1LY-71•只要Ca离子不影响该表面Marker就可以同时做2.线粒体水平的检测激活Caspase9—激活Caspase3—启动细胞凋亡2.线粒体水平的检测•凋亡与线粒体膜电位的去极化相关•BDMitoscreen(JC-1)Cat#55130

5、225tests•JC-1:可穿透细胞膜的亲脂性阳离子荧光素•原理：JC-1在正常细胞中以聚合体形式存在于线粒体基质上产生红色荧光（FL-2Channel）；细胞凋亡时，线粒体膜电位发生去极化，膜电位降低，JC-1以单体形式存在于胞浆内，荧光强度减弱甚至消失，故用荧光信号的变化判别凋亡的发生。p操作简单，试剂直接加入细胞中，20分钟后检测JC-1检测结果流式图JurkatTCellsMouseThymocytesControlControlR1R1R1R2R2R2StaurosporineCamptothecinFasmAbJCR1R1R1-1(Fl-2)R2R2R2

6、JC-1(Fl-1)3.凋亡相关酶的检测-Caspase•背景知识–细胞凋亡过程中，胞内主要蛋白通常被降解，调节这一过程的蛋白叫做Caspase（半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶）–Caspase3是参与DNA维护和调控细胞的重要组分，即Caspase3激活==细胞凋亡–检测原理：是通过特异性抗体检测全长或者剪切后的Caspase活性。Caspase-3data（IHC）JurkatT-Cells6µMcamptothecinfor4huntreatedCaspase-3data（FCM）JurkatT-CellsMouseThymocytesCaspase-3KitsFIT

7、CActiveCaspase-3CatNo.ApoptosisKitFITCActiveCaspase-3550480ApoptosisKitPEActiveCaspase-3550914ApoptosisKitPARPcleaved–Caspase3水解产物•PARPs：一类由DNA链断裂而被激活的DNA修复酶。PARP可以被Caspase-3水解成两个大小分别为24-和89-kDa的片段而失活•PARPcleaved是凋亡细胞中活化的Caspase-3水解产物，代表Caspase酶失去活性•细胞凋亡的标志PARPcleaved–Caspase3水