可用于基因功能研究基因组学工具——诱变

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1、8．可用于基因功能研究的基因组学工具——诱变Alex和erS.Beliaev亚历山大•柏利耶夫朱晨光译；魏华初校,张晓君校对8.1引言随着原核生物研究进入了后测序时代，人们需要用更多的实验方法来促进对细菌基因组的功能研究。时下，许多医学、环境和生物技术领域中重要的微生物研究由于缺乏足够的遗传学方法而受到了限制。尽管DNA芯片技术、用质谱法鉴定蛋白质等研究方法已经或正在被开发以满足此类研究，但这当中诱变法无疑是揭示基因功能的最有效手段之一。了解一个复杂生物系统中的某个特殊基因的功能，是一个需要系统研究的多步骤的过程。最初，关于一个开放阅读框产物功能的信

2、息可以根据生物信息学工具比较分析核苷酸序列来得到(详细讨论请看第三章)。然而并不是一个基因组中所有基因都可以用序列同源性预测其功能，而且，序列同源性并不自动对应相应的功能。不同基因之间存在复杂的进化和结构功能的关系，所以通过序列相似性推知基因功能这一方法会被误导甚至有时是错误的（Strauss和Falkow,1997）。确定基因功能的第二步是通过DNA芯片技术和质谱法辅助的蛋白质组学等表达谱技术，从复杂的细胞环境中衡量基因和蛋白的表达模式（Lockhart和Winzeler,2000;Pandey和Mann,2000）。采用这些技术，可以获得大量的信

3、息，但大部分产生的数据只是相关性的，关于基因功能的结论也是推导出来的（Dean,2001）。第三步，也许是功能分析中最关键的一步，就是为了证实或反驳已有的假设，使被研究的基因失活，并进一步得到失活后的结果。当野生型基因被突变或替代后，比较野生型和突变型的表型差异，可推知该基因的功能。大多数可检测的突变对应着生物体表型的明确而具体的变化。对细菌而言，诱变是一个相对直观的过程，因为细菌是单倍体生物，在单倍体生物中，任何一个单一基因突变都会导致其表达上的改变或者功能上的强弱变化，由此导致细菌的表型也发生可检测的变化。造成突变的方法有许多，诸如化学、物理和遗

4、传学技术。尽管化学和物理因子可以用来构建大量的突变体库，但由于缺乏容易选择的标记而无法用于大规模基因组分析。本章目的并不是对各种诱变研究做一冗长的叙述，而只对那些在细菌基因组功能研究中十分有用的策略做一较为深入的描述。因此，本章拟讨论三种主要的基因组水平上的诱变方法：转座子插入失活、等位交换导致基因失活和通过反义RNA分子阻碍基因的表达。我们将重点讨论这些方法的应用、改进和优缺点，并对每一种方法都提供一些具体的研究范例。8.2转座子诱变正如上所述，任何生物的基因功能和代谢网络的研究都包括产生并分析分布于整个基因组的突变。随着全基因组测序工作的可行性增

5、加，转座子诱变法的应用潜力也迅速增长。转座子插入宿主DNA的随机性导致产生大量的突变体，这些突变体可用于分析某特殊功能或过程的丢失、减弱的原因。许多转座系统已被应用于基因组水平的功能研究，尤其被着重用于研究与生物生存十分重要的基因的鉴定和结构分析。在本章，我们将讨论一些应用插入转座子突变来进行复杂的遗传筛选和在给定条件下鉴定生存必需的基因的方法。8.2.1细菌中的转座概述转座因子的分类转座因子（TEs）是一类能作为不连续的单元转移到基因组其它位置的可移动的DNA序列。这类序列常出现在细菌基因组中。自从上世纪五十年代发现以来（McClintock,19

6、52），来自159种原核生物的500多种TEs已被发现并具体描述，其中相当一部分还被进行了归类（Craig,1996；Mahillon和Chandler，1998）。转座因子在大小、结构、插入特异性和转座机制上多种多样，在细菌中主要分为两类：插入序列（IS）和转座子(Tn)。插入序列是最简单的转座因子，由700bp-1300bp的短DNA片段组成，两端各有一个9-40bps的反向重复序列。这些反向重复序列包围着一个转座相关的基因，叫转座酶基因，它编码一个特异的调控转座的DNA结合蛋白。与插入序列相比，转座子的结构更复杂，因为它包含了编码抗生素和重金属

7、抗性或者分解代谢功能的辅助基因，这些基因都与转座无关。许多转座子如Tn5，Tn9，Tn10组织成“复合”分子，在这些辅助基因两侧各有一个正向或反向的插入序列元件。另外一类TEs，可称之为复杂的转座子，包含一个单一的插入序列因子（两端是30-40bp的倒转重复，中间是数个编码抗性和转移相关的基因）。值得一提的是溶源性整合增变噬菌体如λ噬菌体和μ噬菌体，尽管它们的结构和基因的组成比典型的转座子要复杂得多，但也被认为是TEs，并归为单独的一类（详见Thompson和Landy，1989；Pato，1989）。根据是否在转移过程中复制，可将原核生物的转座子分

8、为两个大类。迄今为止，已有两类转移的机制（保守型和复制型）有文献报道。保守型机制，以Tn5和Tn10家族为例