用于发酵黄芪的益生菌株fgm诱变选育及突变株特性研究

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1、密级：论文编号：中囯农北科学院学位论文用于发酵黄苗的益生菌株FGM诱变选育及突变株特性研究ResearchonMutagenesisandSelectiveBreedingoftheProbioticsStrainFGMandtheCharacteristicsofMutantStrainforFermentingmembranaceus硕士研究生：陈婕指导教师：李建喜申请学位类别：兽医硕士专业领域名称：兽医培养单位：中国农业科学院研究生院兰州畜牧与兽药研究所2015年5月Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationR

2、esearchonMutagenesisandSelectiveBreedingoftheProbioticsStrainFGMandtheCharacteristicsofMutantStrainforFermentingAstragalusmembranaceusM.S.Candidate：JieChenSupervisor：Prof.JianxiLiDegree：MasterofVeterinarianSpecialty:VeterinaryMay2015III摘要黄芪多糖具有多种重要的药理作用，非解乳糖链球菌FGM是分离自鸡盲肠，能够发酵黄芪，提高多糖提取率的益生菌。为了进一步提升菌

3、株FGM的发酵性能，揭示黄芪经发酵后多糖含量提高的潜在机制，本研究采用紫外线（UV）和亚硝基胍（NTG）对FGM进行诱变选育，用诱变菌株发酵黄芪，通过水提醇沉法提取发酵产物中的多糖，苯酚硫酸法测定多糖含量，筛选得到了两株高多糖得率菌株，分别从稳定性、安全性、生化特征、发酵酶的相关基因克隆和表达等方面进行评价和研究，并对菌株进行全基因组测序与比较基因组学分析。具体研究结果如下：（1）采用UV、NTG和UV-NTG复合诱变的方法，对FGM株进行诱变选育。结果显示，UV照射10～120s所得的菌株发酵黄芪后产物中多糖含量均呈升高趋势，NTG处理所得菌株发酵黄芪后产物中多糖含量变化无规律性。UV诱变

4、的最佳条件是在紫外灯下处理90s，最终发酵产物中多糖含量为235.51mg/g，较出发菌株提高了58.13%，将该菌株命名为U90；UV-NTG复合诱变的最佳条件是先用紫外灯照射10s，再用1.0g/L的NTG处理10min，最终其发酵产物中多糖含量可达293.39mg/g，较出发菌株提高了94.99%，将该菌株命名为UN10-1。（2）将U90和UN10-1连续传代10次，每代均分析发酵黄芪后多糖的提取率，评价遗传稳定性。U90连续传6代，取每代菌株发酵黄芪后产物中多糖含量稳定在233.6±1.66mg/g，第4代多糖含量最高，为235.85±0.78mg/g，从7代开始多糖含量随传代次数

5、增加而减少。菌株UN10-1产糖量比较稳定，含量为292.06±0.89mg/g。生化鉴定结果提示，UN10-1连续传代10次产糖量仍趋于稳定的原因可能与其能利用核糖、乳糖、阿拉伯糖有关。（3）分别用UN10-1菌悬液和48h黄芪发酵液灌胃小鼠，0.5mL/次，1次/d，连续灌胃3d，观察7d，灌服等量生理盐水作对照。观察记录小鼠日常行为及体重，测定血液生理指标，观察主要脏器（心、肝、脾、肺、肾、胸腺、小肠）及组织形态学变化。结果显示，UN10-1对小鼠生长发育及组织形态学无不良影响，提示该菌株安全无毒。（4）分析了UN10-1发酵产糖相关基因galE、dexB、aga2、ldh、recA。

6、成功扩增出recA和aga2基因，以recA为内参基因分析了aga2基因在黄芪发酵过程中的表达。结果发现，aga2基因在发酵24h内表达呈上升趋势，24h时该基因表达量是初始发酵的9.54倍；24h～60h该基因表达呈下降趋势，60h～72h又略有升高。（5）比较基因组学分析结果显示，在KEGG数据库中注释得到FGM和UN10-1位于糖代谢通路上的基因分别有125个和124个，SNP检测发现UN10-1有1个无义突变位点和26个位于基因区的非同义突变位点。综上所述，采用UV和NTG复合诱变益生菌FGM可获得发酵黄芪提取多糖性能更优的菌株UN10-1，该菌株对小鼠无毒副作用；诱变菌株UN10-

7、1与出发菌株FGM相比，发酵过程中糖代谢酶相关基因aga2在发酵过程中的表达量有升高趋势；比较基因组学分析结果表明UN10-1有基因突变。关键词：益生菌株FGM，诱变选育，特性，基因表达，全基因组测序IIIAbstractAstragaluspolysaccharideshasattractedmuchinterestbecauseofitsmultipleimportantpharmacologicalac