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1、基因功能研究方法随着生物学研究在分子水平上的不断深入和推进，越来越多的新基因得以成功克隆，对新基因功能的研究显得日益重要，这也是后基因组时代功能基因组学的重要研究内容。1.微阵列分析微阵列(microarray)是近年来发展起来的可用于大规模快速检测基因差异表达、基因组表达谱、DNA序列多态性、致病基因或疾病相关基因的一项研究基因功能的新技术。它包括cDNA微阵列(cDNAmicroarray)和DNA芯片。原理:将成千上万条DNA片段(cDNA、表达序列标签(expressedsequencetag,EST)或特异的寡核苷酸片段)按横行纵列方式有序点样在固
2、相支持物上。固相支持物为硝基纤维膜或尼龙膜时称为微阵列。固相支持物改为指甲盖大小的玻片或硅片时所形成的微阵列就称为DNA芯片。微阵列法分析过程:首先用来自不同生理状态和发育阶段的mRNA作为模板,以放射性同位素或荧光标记的dNTP为底物反转录合成cDNA；其次将所得cDNA与微阵列或DNA芯片进行杂交；最后通过计算机对结果进行判读和处理,这样就可以知道芯片中哪些基因在细胞里表达,哪些基因不表达;同样也可以测知哪些基因的表达水平高,哪些基因的表达水平低。芯片的制作:目前常用的基因芯片制作方法：接触点样法喷黑法原位合成法接触点样法：是将样品直接点在基体上。优点是
3、仪器结构简单、容易研制，是一种快速、经济、多功能的仪器，可以在3.6cm2面积内点上10000个cDNA；不足是每个样品都必须合成好、经过纯化、事先保存的。喷黑法:是以定量供给的方式，通过压电晶体或其他推进形式从很小的喷嘴内把生物样品喷射到玻璃载体上。同样需要合成好的纯样品，包括cDNA、染色体DNA片段和抗体。在1cm2面积上可喷射10000个点。原位合成法：主要是美国Affymetrix公司开发的寡聚核苷酸原位光刻DNA合成技术。原理：在合成碱基单体的5’羟基末端连上一个光敏保护基，利用光照射使羟基端脱保护，然后逐个将5’端保护的核苷酸单体连接上去，这个
4、过程反复进行直至合成完毕。原位合成法的优点：合成循环中探针数目呈指数增长，在1.6cm2面积上合成40万组寡核苷酸。2.基因转导技术基因转导是将目的基因转入某一细胞中,然后观察该细胞生物学行为的变化,从而了解该基因的功能。这是目前应用最多、技术最成熟的研究基因功能的方法之一。但因基因的表达受转导效率和是否持续稳定表达两方面因素的影响。主要方法有物理的、化学的和生物的方法。2.1物理方法1>.DNA直接注射法:是目的基因导入的最简单方法,但注入量有限,能够接触到的细胞有限,故获得的细胞转化率很低,多通过肿瘤局部多点注射给药。2>.颗粒轰击技术:将目的基因包被金
5、属以后,利用高压发射装置,加速包裹目的基因的金属颗粒进入细胞,从而提高肿瘤细胞的转化率。2.2化学方法1>.脂质体载体：方法具有安全、简单、低毒、无免疫原性等优点，适用于注射方法进行器官靶向性转移并有一定的转移效率。是除病毒载体转移方法之外的另一种有价值的体内基因转移方法。2>.受体介导法：利用肝细胞上富含转移因子和糖蛋白受体的特点，人工合成多聚阳离子氨基酸，进而连接转移因子(或糖蛋白)和目的基因构成复合物，通过与肝细胞表面的受体结合来实现目的基因的转移。优点:靶向性好，但受体介导的内吞小泡会被转运到溶酶体，易被溶酶体降解而造成目的基因表达时间短暂，表达效率
6、低下。利用腺病毒与内吞小泡相融合而将其破坏释放出外源DNA，可提高转化效率。2.3生物学方法(主要通过构建病毒载体来完成)：病毒表达载体:以病毒为载体介导的基因转移技术。因其转染效率高、目的基因可稳定表达等优势被广泛应用。1>.逆转录病毒(retrovirus，Rv):构建简单，装载外源基因容量最大达8kb，整合入宿主细胞基因组而无病毒蛋白表达。但仅能感染分裂期细胞，体外制备滴度较低，且其随机整合有引起“插入性突变”的可能。2>.腺病毒(adenovirus,Adv):为近年肝细胞肝癌基因治疗中报告最多的一种病毒载体。装载外源基因容量最大达35kb，不整合入
7、宿主细胞基因组因而避免插入突变的危险，能感染分裂细胞和非分裂细胞。但易引起宿主免疫反应而使转染效率下降。3.反义技术反义技术是根据碱基互补原理,利用人工或生物合成的特异互补的DNA或RNA片段(或其修饰产物)来抑制或封闭目的基因的表达。包括:反义寡核苷酸技术(Antisenseoligonuclerotides,ASON)反义RNA技术核酶(Ribozyme)技术。3.1反义寡核苷酸技术反义核苷酸:是一类经人工合成或构建的反义表达载体表达的寡核苷酸片段，长度多为15-30个核苷酸，通过碱基互补原理，干扰基因的解旋、复制、转录、mRNA的剪接加工乃至输出和翻译
8、等各个环节，从而调节细胞的生长、分化等。根据结合部位
