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1、四川解剖学杂志2007年第15卷第1期·57··综述·基因功能研究的方法李新枝,蔡佩玲,牟林春(成都医学院基础医学院人体解剖学与组织胚胎学教研室,四川成都610083)【中图分类号】Q78【文献标识码】A1985年在加利福尼亚大学SantaCruz分校举行相支持物上。固相支持物为硝基纤维膜或尼龙膜时的一次会议上,有人第一次提出了共同努力测出人类称为微阵列。固相支持物改为指甲盖大小的玻片或基因组序列的可能性,虽然这个主意引起了许多人的硅片时所形成的微阵列就称为DNA芯片。检测时,[1]兴趣,但几乎没有强的支持者。1986年,诺贝尔奖首先用来自不同生理状态和发育
2、阶段的mRNA作为获得者RenatoDulbecco于《Science》上率先提出人模板,以放射性同位素或荧光标记的dNTP为底物类基因组计划(humangenomeproject,HGP),旨在反转录合成cDNA,再用所得cDNA与微阵列或9阐明人类基因组的3×10个碱基对的序列,发现人DNA芯片进行杂交,然后通过计算机对结果进行判类所有基因并阐明其在染色体上的位置,破译人类的读和处理,这样就可以知道芯片中哪些基因在细胞里全部遗传信息,使人类第一次在分子水平上全面认识表达,哪些基因不表达;同样也可以测知哪些基因的[2][3]自我。自1990年正式启动以来,
3、随着人类基因组表达水平高,哪些基因的表达水平低。计划和其它模式生物基因组研究的顺利进行,生命科2基因转导技术学研究已进入后基因组时代。基因组学的研究也从基因转导是将目的基因转入某一细胞中,然后观结构基因组学转向功能基因组学的研究。基因组序察该细胞生物学行为的变化,从而了解该基因的功列测定的完成仅仅是基因组计划的第一步,更大的挑能。这是目前应用最多、技术最成熟的研究基因功能战在于如何确定基因的功能和弄清全部的遗传信息。的方法之一。但因基因的表达受转导效率和是否持因而基因功能研究已成为生命科学领域中的重大课续稳定表达两方面因素的影响,故要慎重选择转导系[4]题,
4、它将是21世纪生命科学研究的重要领域。经典统。常用的基因转导系统有非病毒性和病毒性两的扣除杂交(subtractivehybridization)、差示筛选种。(diferentialscreening)、cDNA替代差异分析(repre-(1)非病毒性表达载体:通过DNA直接注射或sentativediferentialanalysis,RDA)以及mRNA差与多聚赖氨酸、阳离子脂类混合,使目的基因穿过细异显示(diferentialdisplay)等技术已广泛应用于差胞膜。由于转录效率、mRNA的加工、mRNA的稳异表达基因的鉴定和克隆,但这些技术和策略
5、对于从定性及翻译效率、目的基因的拷贝数以及目的蛋白翻基因组测序所获得的大量未知基因的功能研究来说译后加工等因素影响目的基因的表达,因此在选择表[3]是远远不够的。于是,随着后基因组时代的到来,达载体时应注意:内含子序列、内部核糖体进入位点一些能够对大量基因进行全面、系统分析的新技术应(Internalribosomeentrysite,IRES)、选择强启动子运而生。本文主要介绍近年来用于基因功能研究的和增强子及选择高效的多聚腺苷酸加尾信号(Poly较新方法。A)。[1]1微阵列分析(2)病毒表达载体:以病毒为载体介导的基因转微阵列(microarray)是
6、近年来发展起来的可用移技术因其转染效率高、目的基因可稳定表达等优势于大规模快速检测基因差异表达、基因组表达谱、被广泛应用。目前已构建的多种病毒载体各有特点:DNA序列多态性、致病基因或疾病相关基因的一项逆转录病毒载体可携带外源基因并整合到靶细胞的研究基因功能的新技术。它包括cDNA微阵列(cD-基因组中,从而实现目的基因的稳定持久表达,某些NAmicroarray)和DNA芯片。亚型几乎能稳定转导100%靶细胞,但缺点是只能感其基本原理是:将成千上万条DNA片段(cD-染正在分裂的细胞,且有插入突变和激活癌基因的危NA、表达序列标签(expressedseq
7、uencetag,EST)或险;人腺病毒载体具宿主范围广、装载量大(重组腺病特异的寡核苷酸片段)按横行纵列方式有序点样在固毒最大包装容量为野生型的105%)等优点,是对分·58·SICHUANJOURNALOFANATOMYVOL.15NO.12007裂细胞和静息细胞均有效的基因转导系统,但不能将目前利用基因敲除得到转基因动物的程序可简外源基因整合到细胞染色体上,所介导的基因只能短述如下:(1)克隆基因组中某一基因的全部或部分暂表达,这一特点使腺病毒载体特别适用于某些骨病DNA序列,用插入、删除、置换、修饰等手段重建的基因治疗,缺点是同时表达大量病毒蛋白,引
8、起机DNA序列,使之成为靶载体;(2)将靶载体导入小
