基因功能的研究方法ppt课件

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1、第十章.基因功能的研究方法（一）一、计算机预测基因功能二、实验确认基因功能1．基因失活是功能分析的主要手段1.1基因敲除（Geneknock-out）1.2基因敲除的技术路线1.3基因敲除的主要应用领域及国内外研究进展1.4基因失活的表型效应有时不易分辨2．转座子突变库的构建2.1插入序列2.2实验步骤3．内含子归巢突变4．基因的超表达用于功能检测5.反义RNA5.1反义RNA的分类和作用机制5.2ticRNA(transcriptioninhibitorycomplementaryRNA)5.3反义RNA

2、的功能5.3.1调控细菌基因的表达5.3.2噬菌体溶菌/溶源状态的控制5.3.3IS10转位作用的抑制5.4人工合成构建反义RNA5.5使反义RNA分子稳定的方法三、其他的基因功能研究方法１．噬菌体展示(phagedisplay)２．酵母双杂交(yeasttwo-hybridization)2.1概念2.2实验步骤2.3利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能2.4利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用2.5利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响2.6利用酵母双杂交

3、建立基因组蛋白连锁图(GenomeProteinLinkageMap）3.开放读框顺序标签(open-reading-framesequencetags,OSTs）确认DNA顺序中的基因序列后，下一个问题就是探知其功能，这是基因组研究的一个难度很大的领域。一些已完成测序的基因组顺序分析表明，我们所了解的基因组内容比真实的情况少的多。如大肠杆菌与啤酒酵母，在未开始基因组测序前已经完成了大量常规的遗传学分析，当时遗传学家认为这2种生物的大多数基因已经通过突变鉴定，但实际上还有很多空白。大肠杆菌编码蛋白质的428

4、8个基因中，以往知道的只有1853个，仅占43%。至于啤酒酵母，所知更少，仅为30%。一、计算机预测基因功能计算机预测基因功能的依据仍然是同源性比较。同源基因都有1个共同的祖先基因，他们之间有许多相似的顺序。同源基因可以分为2类：同源性分析可以给出整个基因或某一区段功能的信息同源查询除了直接比较DNA顺序外，还可将DNA顺序翻译为aa顺序。由于组成蛋白质的aa有20多种，而DNA核苷酸只有4种，因此aa顺序的差异要比核苷酸的差异大的多。以aa顺序进行同源性比较的结果更为准确，也更加可行。已有许多软件可用于

5、这项分析，常用的是BLAST。研究者只要将资料以正确格式的电子邮件发送到DNA资料库BLAST服务站，很快就会得到回音。有时在2个无明显亲缘关系的基因之间会出现局部相似的区段。这种情况表明，2个无亲缘关系的蛋白质可能具有相似的功能，相似的顺序是功能的核心区域。虽然基因本身无共同的祖先，但其功能域却有共同的起源。它们都是古老祖先的后裔，在进化中一方面发生独立突变，另一方面又因基因组重排成为新基因的组成部分。例如信号传导蛋白，这类蛋白质一般都有2个基本的功能域，即接受信号的功能域和传达信号的激酶域。二、实验确认

6、基因功能同源性分析并非万灵药方，对许多新基因的功能分析还必需依赖其他的实验手段进行补充，并将同源性研究的结果进一步外延。如何确定一个基因的功能是基因组计划中最困难的问题之一。大多数分子生物学家认为现有的技术与策略对于从基因组测序所获得的大量未知基因的功能研究是远远不够的。基因的功能是一个过程，是从基因到表型的一系列反应。传统的遗传分析是从表型出发最终到达基因；现在的基因功能研究是从基因出发直接推导表型。因此必须寻找一系列的实验方法来鉴别与目标基因相关的表型。1．基因失活是功能分析的主要手段传统的遗传分析主要

7、借助突变型研究表型变异的遗传基础，利用紫外线诱导及化学试剂处理可使生物群体产生突变个体，也可从自然的群体中发现突变体。经遗传分析将突变基因定位，然后观察这一突变体是否与改变的表型对应。在此基础上采用分子生物学方法进一步分离与克隆目标基因。所谓定位克隆就是根据与突变位点连锁的分子标记，然后通过物理图寻找靶位点。上述传统遗传学分析的原理同样可用来设计从基因到表型的研究。如果我们能找到某种方法，根据待测基因的顺序使生物体内该基因失活，亦可鉴别由此产生的表型变异。1.1基因敲除（Geneknock-out）概念：基

8、因敲除除可中止某一基因的表达外，还包括引入新基因及引入定点突变。即可以是用突变基因或其它基因敲除相应的正常基因，也可以用正常基因敲除相应的突变基因。基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的一门新技术。80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完