家兔全卵巢程序化和玻璃化冷冻方法效果的比较研究

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1、论文题目：塞鱼全鲤巢程庄丝塑遮埴毡猃途友法煎墨趁出筮班究答辩委员会主席：奎丝丞熬援答辩委员会成员：塑玉亟塾援赵垩招塾拯目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯9材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯19分析与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．26结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．

2、30参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．31附录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．34致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．35综述人卵巢组织冷冻和移植的研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．36综述参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．4o论文独创性声明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．42温州医学院硕士学位论文兔全卵巢程序化和玻璃化冷冻方法效果的比较研究中文摘要目的近年来，随着医学上诊断及治疗技术的提高，新的放化疗方案的应用使得癌症患者的生存率不断的提

3、高，但在癌症患者年轻化和生存率提高的前提下，仍然存在一个重要的问题，放化疗对卵巢造成的不可逆损害，使得年轻女性出现卵巢早衰(POF)及生育能力严重受损，如何保存高治愈率年轻女性癌症患者的卵巢功能成为研究的热点。在目前保存女性生殖能力的方法中，卵巢组织片的冷冻保存和自体移植是一种较为成熟的方法，目前已经应用于临床，但因冻融卵巢组织片无法立即建立血供导致缺血缺氧损伤而引起大量卵泡的丢失，移植效率低下已成为全面开展该技术临床应用的阻碍之一。全卵巢冷冻保存和移植不失为一种较好的方法，理论上可以通过血管吻合立即恢复血液供应减少卵泡的丢失，是未来

4、的一个研究方向。但全卵巢相对体积大，组成细胞成分复杂，比卵巢组织片冷冻保存更加难操作，进一步开展动物实验，优化全卵巢冷冻保存方法是有必要的。目前的研究中主要从冷冻保存的方法、冷冻保护剂的配伍、冷却速率及冷冻剂渗透方式等方面来优化全卵巢的冷冻模型，家兔全卵巢冷冻保存不失为一种常见的动物模型，但对其研究不多。故本实验中通过不同冷冻保护剂的配伍和兔全卵巢灌注模型，采用程序化冷冻和玻璃化冷冻保存后，对其冷冻保存效果进行比较研究，从面优选出适宜兔全卵巢冷冻保存的方法，为人全卵巢冷冻保存奠定实验基础。方法卵巢灌注及冷冻：取13只日本大耳白兔共26

5、个带血管蒂兔全卵巢，采用本课题组专利“微血管灌注装置”经卵巢动脉以1．3ml／min的速率灌注。(1)1个卵巢行明胶墨汁灌注后进行固定HE染色，以证实全卵巢灌注系统的成功建立。(2)实验分组(5个卵巢／组)：灌注冷冻保护液1．5MPROH+L一15+10％，FBS(A组，1．5MDMSO+L．15+10％FBS(B组)30min；依次灌注玻璃化平衡液7．5％EG+7．5％PROH+L一15+20％FBS15min，玻璃化冷冻15％EG+15％PROH+L．15+S15min(C组)：依次灌注7．5％EG+7．5％DMSO+L一15+2

6、0％FBS15rain，15％EG+15％DMSO+L一15+S15min(D组)：新鲜组为对照组(F组)。A、B温州医学院硕士学位论文两组经程序化冷冻，C、D两组经玻璃化冷冻，置于液氮中至少保存1周，然后采用相同的速率及相对应的解融液灌注冷冻的兔全卵巢，将解融后的卵巢沿纵轴剪开，将整个卵巢切成4块。解融后指标检N-1／4个卵巢固定于4％多聚甲醛中，石蜡包埋、切片，HE染色后在光镜下进行形态学分析，观察卵泡形态及血管结构评估冻融损伤及TUNEL检测卵巢组织在冻融过程中产生的DNA断裂片段；1／4个卵巢切成大小约1木1，．clmm3小块

7、电镜包埋处理，透射电镜下观察卵母细胞、卵泡细胞、颗粒细胞及线粒体等结构，比较各组卵巢组织超微结构的变化；1／4个卵巢行卵泡活力测试，经酶结合机械分离卵泡后细胞活性鉴别染液(20ulEthidiumhomodimer．1+5ulcalceinAM+10mlD-PBS)，荧光显微镜下观察并计数(活的细胞为绿色荧光，死的细胞为红色荧光)，于共聚焦显微镜下拍照；1／8个卵巢行乳酸脱氢酶(LDH)定量检测其冷冻损伤程度；另余1／8置于液氮中保存。另取家兔全卵巢切成4块分别检测各指标作为新鲜对照组。结果1．兔全卵巢墨汁灌注模型的建立经明胶墨汁灌注

8、后行HE染色的卵巢组织切片中可见墨汁已从卵巢门血管进入卵巢内部的血管，表明兔全卵巢灌注系统的成功建立。2．程序化慢冻和玻璃化冷冻方法对兔全卵巢卵泡及血管的组织形态学的影响1)经HE染色观察四组冻融的兔卵巢组织及新鲜对照组