胎儿卵巢组织玻璃化冻存效果的研究

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1、胎儿卵巢组织玻璃化冻存效果的研究【摘要】目的探讨玻璃化冻存法对胎儿卵巢组织形态和功能的保存效果。方法采用改良EG5.5/30玻璃化液冻存胎儿卵巢皮质片，解冻后观察卵巢组织学变化，卵巢皮质片异种异位移植后,观察受体鼠动情周期恢复率、恢复时间、卵泡发育状况。结果实验组与新鲜培养后移植组、添加抗氧化剂培养后移植组相比动情周期恢复率差异无统计学意义(P＞0.05)，但高于新鲜移植组(P＜0.005)；动情周期恢复需要的天数接近于新鲜移植组，明显短于两种培养组(P＜0.05)；在卵泡计数上，实验组每高倍视野的卵泡计数明显高

2、于新鲜移植组(P＜0.005)，与培养后移植组间的差异无统计学意义(P＞0.05)。移植后18周，组织学观察见大量窦卵泡，而培养组仅偶见窦卵泡。结论玻璃化冻存法可有效冻存胎儿卵巢组织，且不影响卵泡继续发育的潜能。【关键词】胎儿卵巢组织玻璃化冻存异种异位移植　　Abstract:ObjectiveToinvestigatetheeffectsofcryoprotectiveonmorphologyandfunctionoffetalovariestissuebyvitrificationpreservation.M

3、ethodsTetalovarie'stissueprovedEG5.5/30vitrificationsolutions.Afterbeingthainedhistologically,andxenotransplantationent,soastoevaluatethecryopretectiveeffectofvitrificationpreservation.ResultsThereongthevitrificationtransplantedgroupandtheteclosetothatoffresh

4、transplantedgroup.inthenumberoffollicles,vitrificationtransplantedgroupshoountofantralfolliclesentpotentialoffollicles.　　Keym×2mm×1mm大小的皮质块待用。　　1.1.3实验用液体的配制：冷冻保护液(cryoprotectant，CPA)和解冻液均采用含10％小牛血清的DMEM和F12培养液作为基础液。所需液体在此基础上添加不同浓度的乙二醇(EG)、蔗糖、聚蔗糖及β-巯基乙醇(β-ME)

5、。冷冻保护液：①预渗透平衡液为1.5MEG；②玻璃化液采用我室研制的EG5.5/30液。③解冻液分别为含0.5、0.25、0.125mol/L蔗糖的基础液配制。④培养液：A液含10％小牛血清的DMEM和F12的基础培养液；B液在A液的基础上添加100μM的β-ME。　　1.2方法　　1.2.1胎儿卵巢组织的冻融：冷冻管为0.5mL的国产塑料麦管，直径0.5cm,长8cm。1)冷冻方法：①将要冻存的皮质块侵入1.5MEG预渗透平衡15min；②将预渗透平衡后的皮质块移入EG5.5/30玻璃化液继续渗透平衡5～6mi

6、n；③在第二步渗透平衡过程中，将皮质块装入冷冻麦管内，每管8枚皮质块，全过程在22～24℃下进行；④麦管不封口，在卵巢接触玻璃化液的5～6min时将麦管投入-196℃的液氮罐中保存。2)解冻方法：卵巢皮质块冻存1～7d后，将麦管从液氮中取出，室温下停留10s，置于37℃水浴中20s。剪开麦管一端，卵巢皮质块连同保护液一起流入盛有1mL、0.5M蔗糖解冻液的表面皿中，充分晃动，渗透平衡5min后，在0.25、0.125M含20％小牛血清的蔗糖液内依次洗脱5min，最后入PBS液充分洗涤，一部分入Bouin液进行固定

7、，用于石蜡切片组织学分析，一部分入DMEM+F12培养液，置于CO2培养箱，30min后移植。　　1.2.2新鲜胎儿卵巢组织的培养方法：将新鲜胎儿卵巢皮质块随机放入加有2mL培养液A液或B液的培养瓶内，以棉塞封口,放入5％CO2培养箱内37℃培养3d后进行异种异位移植。　　1.2.3卵巢移植实验分组：1)对照组：①新鲜移植组(freshtransplantationgroup，FTG组)，取出后即移植；②新鲜培养后移植组(培养液为A液)(culturedandtransplantationgroup，CTG组)；

8、③添加抗氧化剂β-ME100新鲜培养后移植组(培养液为B液，culturedinβ-ME100andtransplantationgroup，β-ME100CTG组)。　　2)实验组：玻璃化冻存后移植组(vitrificationpreservationandtransplantationgroup，VG)。　　1.3冷冻效果的判断　　1.3.1新鲜及解冻后卵巢组织切片观