外源性HPV16E7癌基因表达对宫颈癌HeLa细胞CyclinE表达的影响

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1、外源性HPV16E7癌基因表达对宫颈癌HeLa细胞CyclinE表达的影响【摘要】目的研究重组腺病毒介导人乳头状瘤病毒(HPV)16型E7病毒癌基因感染对人宫颈癌HeLa细胞周期蛋白E(CyclinE)表达的影响,探讨HPV16E7癌基因以及CyclinE在宫颈癌发生发展中的作用。方法用含有HPV16E7病毒癌基因的重组腺病毒载体感染体外培养的人宫颈癌HeLa细胞。免疫荧光染色后激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)检测感染前后CyclinE表达的差异。结果HPV16E7感染后CyclinE表达较感染前明显增加。结论HPV16E7基因的表达促进CyclinE的表达，对

2、宫颈肿瘤细胞有增殖促进的作用。【关键词】乳头状瘤病毒人基因E7感染宫颈肿瘤细胞周期蛋白E［ABSTRACT］ObjectiveToinvestigatetheexpressionofCyclinEinHeLacellsafterthetransfectionofHPV16E7oncogenebyrecombinantadenovirusvector,andassesstheeffectofHPV16E7oncogeneandCyclinEinthedevelopmentofhumancervicalcarcinoma.MethodsExpressionofCyc

3、linEwasdetectedbylaserscanningconfocalmicroscope(LSCM)beforeandafterthetransfection.ResultsExpressionofCyclinEproteinintheHeLacellsincreasedsignificantlyafterthetransfectionofHPV16E7genes.ConclusionExpressionofHPV16E7oncogeneinfluencestheexpressionofCyclinEandenhancesthe8proliferatio

4、nofthecellsofcervicalcarcinoma.［KEYWORDS］papillomavirus,human;genes,E7;infection;cervixneoplasms;CyclinE宫颈癌是女性高发恶性肿瘤,在全球女性恶性肿瘤中其发病率仅次于乳癌,在我国则居首位。人乳头状瘤病毒(HPV)的感染是宫颈癌发生发展的主要因素。HPV16/18DNA的检出率在宫颈浸润癌可达90%［1］。HPV16型E7(HPV16E7)病毒癌基因被认为是潜在的致癌基因,其编码的产物可与细胞内癌基因和抑癌基因相互作用而使细胞失去正常功能,从而导致细胞恶变。细胞周

5、期蛋白E（CyclinE）是G1期细胞周期蛋白,在G1晚期调控和G1/S期转换过程中起关键作用。本研究使用腺病毒表达载体介导HPV16E7基因在宫颈癌细胞株HeLa中表达，研究HPV16E7病毒癌基因对HeLa细胞周期蛋白CyclinE的影响，以探讨HPV16E7癌基因和CyclinE在宫颈癌发生发展中的作用。1材料和方法1.1实验材料含有HPV16E7病毒癌基因的重组腺病毒载体为我实验室所构建，并在人胚肾细胞株HEK293细胞中包装成完整腺病毒，置-80℃保存。所用载体为AdEasy系统，包含腺病毒骨架质pAdEasy1和穿梭质粒pAdTrackCMV，

6、其中pAdTrackCMV中含有编码绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）的基因。RPMI1640、DMEM、血清及TritonX100均购自美国GBICO公司。宫颈癌上皮HeLa细胞为青岛大学医学院微生物学实验室保存。Cyclin8E单克隆抗体购自美国BD公司。二抗为四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC,美国VECTOR公司）标记羊抗鼠IgG。德国ZEISS公司激光扫描共聚焦显微镜（LSM510Meta）及计算机系统。1.2实验方法1.2.1细胞制备取1瓶生长至90％融合的宫颈癌细胞系HeLa，按常规方法传代培养细胞，将细胞以

7、3×108/L浓度接种于含盖玻片的六孔板中制备细胞爬片,培养液为含体积分数0.10胎牛血清的RPMI1640。2d后对其中3孔细胞进行感染,另3孔仍进行常规细胞培养作为同期对照。置37℃、含体积分数0.05CO2饱和湿度培养箱内培养。1.2.2含有HPV16E7病毒癌基因的重组腺病毒AdE7感染HeLa细胞感染时将细胞培养液更换为无抗生素、无血清的新鲜RPMI1640培养液（每孔1mL），二氧化碳培养箱中孵育30min。将病毒上清50μL（病毒滴度3×1014pfu/L）加至1mL的RPMI1640培养基中，轻轻混匀，培养箱中孵育90min后补加体积分数0.0

8、5的完全培养基。36h后