外源性hpv16 e7癌基因表达对宫颈癌hela

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1、外源性HPV16E7癌基因表达对宫颈癌HeLa【摘要】目的研究重组腺病毒介导人乳头状瘤病毒(HPV)16型E7病毒癌基因感染对人宫颈癌HeLa细胞周期蛋白E(CyclinE)表达的影响,探讨HPV16E7癌基因以及CyclinE在宫颈癌发生发展中的作用。方法用含有HPV16E7病毒癌基因的重组腺病毒载体感染体外培养的人宫颈癌HeLa细胞。免疫荧光染色后激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)检测感染前后CyclinE表达的差异。结果HPV16E7感染后CyclinE表达较感染前明显增加。结论HPV16E7基因的表达促进CyclinE的表达，对宫颈肿瘤细胞有增殖促进的作用。【关键词】

2、乳头状瘤病毒人基因E7感染宫颈肿瘤细胞周期蛋白E［ABSTRACT］ObjectiveToinvestigatetheexpressionofCyclinEinHeLacellsafterthetransfectionofHPV16E7oncogenebyrebinantadenovirusvector,andassesstheeffectofHPV16E7oncogeneandCyclinEinthedevelopmentofhumancervicalcarcinoma.MethodsExpressionofCyclinEicroscope(LSCM)beforeanda

3、fterthetransfection.ResultsExpressionofCyclinEproteinintheHeLacellsincreasedsignificantlyafterthetransfectionofHPV16E7genes.ConclusionExpressionofHPV16E7oncogeneinfluencestheexpressionofCyclinEandenhancestheproliferationofthecellsofcervicalcarcinoma.［KEYV，其中pAdTrackCMV中含有编码绿色荧光蛋白（greenflu

4、orescentprotein，GFP）的基因。RPMI1640、DMEM、血清及TritonX100均购自美国GBICO公司。宫颈癌上皮HeLa细胞为青岛大学医学院微生物学实验室保存。CyclinE单克隆抗体购自美国BD公司。二抗为四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC,美国VECTOR公司）标记羊抗鼠IgG。德国ZEISS公司激光扫描共聚焦显微镜（LSM510Meta）及计算机系统。1.2实验方法1.2.1细胞制备取1瓶生长至90％融合的宫颈癌细胞系HeLa，按常规方法传代培养细胞，将细胞以3×108/L浓度接种于含盖玻片的六孔板中制备细胞爬片,培养液为含体积分数0.10

5、胎牛血清的RPMI1640。2d后对其中3孔细胞进行感染,另3孔仍进行常规细胞培养作为同期对照。置37℃、含体积分数0.05CO2饱和湿度培养箱内培养。1.2.2含有HPV16E7病毒癌基因的重组腺病毒AdE7感染HeLa细胞感染时将细胞培养液更换为无抗生素、无血清的新鲜RPMI1640培养液（每孔1mL），二氧化碳培养箱中孵育30min。将病毒上清50μL（病毒滴度3×1014pfu/L）加至1mL的RPMI1640培养基中，轻轻混匀，培养箱中孵育90min后补加体积分数0.05的完全培养基。36h后在荧光显微镜下观察GFP的表达。1.2.3免疫荧光染色检测将细胞爬片先

6、用预温的1mmol/L磷酸缓冲液（PBS）洗涤5min,共3次,然后用冰冷的40g/L多聚甲醛固定1h。PBS洗涤5min，共3次，TritonX100破膜15min，PBS洗涤后用体积分数0.10羊血清封闭30min。在各细胞爬片上分别加入鼠抗人CyclinE抗体（稀释浓度为1∶100),室温孵育30min后荧光洗液洗涤5min，共3次。然后分别加入TRITC标记的羊抗鼠IgG(稀释浓度1∶100)室温避光放置30min,荧光洗液同上洗涤。最后用无荧光的缓冲甘油封片。抗体稀释均用体积分数0.10牛血清清蛋白（BSA）溶液。感染HeLa细胞中选取一孔用PBS置换一抗作空白

7、对照,未感染HeLa细胞同样设置空白对照。于LSM510Meta激光扫描共聚焦显微镜下观察结果,biFCSLSMMETA软件进行分析。用于TRITC检测的激发光波长为543nm,用于GFP检测的激发光波长为488nm。2结果感染重组腺病毒后HeLa细胞在488nm波长激发光下胞质呈黄绿色,弥漫于整个胞质,感染率达80％。在543nm波长激发光下CyclinE呈鲜艳的红色阳性荧光信号，主要分布在胞核中，部分分布在细胞质。对照组荧光染色均呈阴性。3讨论激光扫描共聚焦显微镜是近年来发展起来的一种结合激光扫描、计算机自动