外源性hpv16 e7癌基因表达对宫颈癌hela细胞cyclin e表达的影响

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1、外源性HPV16E7癌基因表达对宫颈癌HeLa细胞CyclinE表达的影响【关键词】乳头状瘤病毒人基因E7感染宫颈肿瘤细胞周期蛋白E［ABSTRACT］ObjectiveToinvestigatetheexpressionofCyclinEinHeLacellsafterthetransfectionofHPV16E7oncogenebyrebinantadenovirusvector,andassesstheeffectofHPV16E7oncogeneandCyclinEinthedevelopment

2、ofhumancervicalcarcinoma.MethodsExpressionofCyclinEicroscope(LSCM)beforeandafterthetransfection.ResultsExpressionofCyclinEproteinintheHeLacellsincreasedsignificantlyafterthetransfectionofHPV16E7genes.ConclusionExpressionofHPV16E7oncogeneinfluencestheexpres

3、sionofCyclinEandenhancestheproliferationofthecellsofcervicalcarcinoma.［KEYV，其中pAdTrackCMV中含有编码绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）的基因。RPMI1640、DMEM、血清及TritonX100均购自美国GBICO公司。宫颈癌上皮HeLa细胞为青岛大学医学院微生物学实验室保存。CyclinE单克隆抗体购自美国BD公司。二抗为四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC,美国VECTOR公司）

4、标记羊抗鼠IgG。德国ZEISS公司激光扫描共聚焦显微镜（LSM510Meta）及计算机系统。1.2实验方法1.2.1细胞制备取1瓶生长至90％融合的宫颈癌细胞系HeLa，按常规方法传代培养细胞，将细胞以3×108/L浓度接种于含盖玻片的六孔板中制备细胞爬片,培养液为含体积分数0.10胎牛血清的RPMI1640。2d后对其中3孔细胞进行感染,另3孔仍进行常规细胞培养作为同期对照。置37℃、含体积分数0.05CO2饱和湿度培养箱内培养。1.2.2含有HPV16E7病毒癌基因的重组腺病毒AdE7感染HeLa

5、细胞感染时将细胞培养液更换为无抗生素、无血清的新鲜RPMI1640培养液（每孔1mL），二氧化碳培养箱中孵育30min。将病毒上清50μL（病毒滴度3×1014pfu/L）加至1mL的RPMI1640培养基中，轻轻混匀，培养箱中孵育90min后补加体积分数0.05的完全培养基。36h后在荧光显微镜下观察GFP的表达。1.2.3免疫荧光染色检测将细胞爬片先用预温的1mmol/L磷酸缓冲液（PBS）洗涤5min,共3次,然后用冰冷的40g/L多聚甲醛固定1h。PBS洗涤5min，共3次，TritonX100破

6、膜15min，PBS洗涤后用体积分数0.10羊血清封闭30min。在各细胞爬片上分别加入鼠抗人CyclinE抗体（稀释浓度为1∶100),室温孵育30min后荧光洗液洗涤5min，共3次。然后分别加入TRITC标记的羊抗鼠IgG(稀释浓度1∶100)室温避光放置30min,荧光洗液同上洗涤。最后用无荧光的缓冲甘油封片。抗体稀释均用体积分数0.10牛血清清蛋白（BSA）溶液。感染HeLa细胞中选取一孔用PBS置换一抗作空白对照,未感染HeLa细胞同样设置空白对照。于LSM510Meta激光扫描共聚焦显微镜下

7、观察结果,biFCSLSMMETA软件进行分析。用于TRITC检测的激发光波长为543nm,用于GFP检测的激发光波长为488nm。2结果感染重组腺病毒后HeLa细胞在488nm波长激发光下胞质呈黄绿色,弥漫于整个胞质,感染率达80％。在543nm波长激发光下CyclinE呈鲜艳的红色阳性荧光信号，主要分布在胞核中，部分分布在细胞质。对照组荧光染色均呈阴性。3讨论激光扫描共聚焦显微镜是近年来发展起来的一种结合激光扫描、计算机自动化分析与显微镜技术的新技术，具有图像清晰，特异性高、敏感性强的优点。由于LSCM

8、是采取激光和被激发荧光的双重聚焦技术，焦点之外的光被挡在挡板以外且不在图像上成图，具有细胞“CT”之称。LSCM在形态学上的直观性是其他技术无法比拟的，为蛋白质表达的定位分析提供了更加丰富的生物学信息。在本实验中，利用LSCM可以直接观察绿色荧光蛋白表达情况，从而简单迅速判定感染成功与否及感染效率的高低。同时，在LSCM下直观观察红色荧光可清晰明了地判定CyclinE的定位、定量表达情况。目前普遍认为，HPV感染