外源性hpv16 e7癌基因表达对宫颈癌hela细胞cyclin e表达的影响论文

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1、外源性HPV16E7癌基因表达对宫颈癌HeLa细胞CyclinE表达的影响论文【摘要】目的研究重组腺病毒介导人乳头状瘤病毒(HPV)16型E7病毒癌基因感染对人宫颈癌HeLa细胞周期蛋白E(CyclinE)表达的影响,探讨HPV16E7癌基因以及CyclinE在宫颈癌发生发展中的作用。方法用含有HPV16E7病毒癌基因的重组腺病毒载体感染体外培养的人宫颈癌HeLa细胞。免疫荧光染色后激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)检测感染前后CyclinE表达的差异。结果HPV16E7感染后CyclinE表达较感染前明显增加。结论HPV16E7基因的表达促进

2、CyclinE的表达，对宫颈肿瘤细胞有增殖促进的作用。【关键词】乳头状瘤病毒人基因E7感染宫颈肿瘤细胞周期蛋白E［ABSTRACT］ObjectiveToinvestigatetheexpressionofCyclinEinHeLacellsafterthetransfectionofHPV16E7oncogenebyrebinantadenovirusvector,andassesstheeffectofHPV16E7oncogeneandCyclinEinthedevelopmentofhumancervicalcarcinoma.Met

3、hodsExpressionofCyclinEicroscope(LSCM)beforeandafterthetransfection.ResultsExpressionofCyclinEproteinintheHeLacellsincreasedsignificantlyafterthetransfectionofHPV16E7genes.ConclusionExpressionofHPV16E7oncogeneinfluencestheexpressionofCyclinEandenhancestheproliferationofthec

4、ellsofcervicalcarcinoma.［KEYV，其中pAdTrackCMV中含有编码绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein.freelL），二氧化碳培养箱中孵育30min。将病毒上清50μL（病毒滴度3×1014pfu/L）加至1mL的RPMI1640培养基中，轻轻混匀，培养箱中孵育90min后补加体积分数0.05的完全培养基。36h后在荧光显微镜下观察GFP的表达。1.2.3免疫荧光染色检测将细胞爬片先用预温的1mmol/L磷酸缓冲液（PBS）洗涤5min,.freelin，共3次，TritonX100

5、破膜15min，PBS洗涤后用体积分数0.10羊血清封闭30min。在各细胞爬片上分别加入鼠抗人CyclinE抗体（稀释浓度为1∶100),室温孵育30min后荧光洗液洗涤5min，共3次。然后分别加入TRITC标记的羊抗鼠IgG(稀释浓度1∶100)室温避光放置30min,荧光洗液同上洗涤。最后用无荧光的缓冲甘油封片。抗体稀释均用体积分数0.10牛血清清蛋白（BSA）溶液。感染HeLa细胞中选取一孔用PBS置换一抗作空白对照,未感染HeLa细胞同样设置空白对照。于LSM510Meta激光扫描共聚焦显微镜下观察结果,biFCSLSMMETA

6、软件进行分析。用于TRITC检测的激发光波长为543nm,用于GFP检测的激发光波长为488nm。2结果感染重组腺病毒后HeLa细胞在488nm波长激发光下胞质呈黄绿色,弥漫于整个胞质,感染率达80％。在543nm波长激发光下CyclinE呈鲜艳的红色阳性荧光信号，主要分布在胞核中，部分分布在细胞质。对照组荧光染色均呈阴性。3讨论激光扫描共聚焦显微镜是近年来发展起来的一种结合激光扫描、计算机自动化分析与显微镜技术的新技术，具有图像清晰，特异性高、敏感性强的优点。由于LSCM是采取激光和被激发荧光的双重聚焦技术，焦点之外的光被挡在挡板以外且不在

7、图像上成图，具有细胞“CT”之称。LSCM在形态学上的直观性是其他技术无法比拟的，为蛋白质表达的定位分析提供了更加丰富的生物学信息。在本实验中，利用LSCM可以直接观察绿色荧光蛋白表达情况，从而简单迅速判定感染成功与否及感染效率的高低。同时，在LSCM下直观观察红色荧光可清晰明了地判定CyclinE的定位、定量表达情况。目前普遍认为，HPV感染及其引发的抑癌基因功能丧失和细胞周期调控失调是宫颈癌发病的重要因素。HPV感染是导致宫颈癌发生的主要病因，HPV的致癌作用主要通过E6、E7实现［2］。研究表明，HPV16E7基因编码的HPV16E7蛋

8、白能和细胞内的Rb蛋白结合释放出E2F，从而诱导细胞周期S期的相关基因表达,促使细胞进入S期。CyclinE是G1期细胞周期蛋白,作为细胞周期素依赖激酶CDK2的调