角质形成细胞对胞内金黄色葡萄球菌抗菌作用研究

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1、角质形成细胞对胞内金黄色葡萄球菌抗菌作用研究作者：刘明岩耿会珍蒋献黄宁王伯瑶吴琦【摘要】目的：观察金黄色葡萄球菌在人角质形成细胞株HaCaT中生存的动态变化，了解金黄色葡萄球菌与皮肤角质形成细胞之间的相互关系。方法：用金黄色葡萄球菌标准株ATCC25923侵袭HaCaT细胞，分别于细菌进入细胞后的4、24、48、72h裂解细胞，释放出细胞内的活细菌，用平板菌落计数法计数胞内活菌。结果：金黄色葡萄球菌ATCC25923株在进入HaCaT细胞的24h有一定生长，但实验48h细胞内活菌数量明显减少。蛋白激酶C激

2、活剂PMA和腺苷酸环化酶激活剂FSK可以促进HaCaT细胞清除胞内细菌。结论：皮肤角质形成细胞清除进入细胞内的金黄色葡萄球菌，可能是皮肤天然免疫的一种防御机制，而PMA和FSK增强细胞的抗菌作用，提示角质形成细胞抗菌活性与NADPH氧化酶相关。【关键词】角质形成细胞;金黄色葡萄球菌;抗菌作用9天然免疫系统是机体抵御病原体入侵的第一道防线，它能够在获得性免疫系统产生针对性更强的特异应答之前，率先消除或减轻由病原体入侵所造成的后果。天然免疫通过物理、化学与生物学屏障，阻挡或消灭入侵的病原体，同时减轻组织损伤与

3、细胞坏死，遏制病原体可能引起的病理生理学改变。上皮细胞是天然免疫的重要组成部分，最近的研究显示，通过上皮细胞与细菌的直接接触，或者上皮细胞吞噬摄取细菌，上皮细胞有很强的抗菌能力。　　角质形成细胞在皮肤免疫防御和炎症反应中功能活跃，是皮肤复杂生化防御机制的细胞基础,由角质形成细胞产生的抗菌效应分子形成了皮肤的抗菌屏障(Antimicrobialbarrier)。金黄色葡萄球菌在医学上占据重要地位，既可以引起局部感染，也可以造成全身系统性感染。在皮肤感染中金黄色葡萄球菌是最常见的致病菌，但正常皮肤有时也可以检

4、出金黄色葡萄球菌，因此研究角质形成细胞与金黄色葡萄球菌的关系对认识皮肤抗感染防御机制及皮肤感染性疾病发病机理都有帮助。本文观察了金黄色葡萄球菌在角质形成细胞中的存活情况。　　1材料与方法　　1.1材料　　金黄色葡萄球菌(ATCC)标准株25923本室保存，人角质形成细胞株HaCaT为本室保存。RPMI1640为GIBCO产品，新生牛血清购自兰州民海生物工程有限公司，TritonX100，佛波酯(PMA)、Forskolin(FSK)购自Sigma公司。9　　1.2方法　　1.2.1细菌培养　　从LB平

5、板中挑取单菌落接种于5mlLB液体培养基，150转·min-1振荡培养3～5h，取100ul菌液铺于LB固体培养板，37℃孵箱培养16h后收集活菌，用PBS洗涤细菌三次，紫外分光光度计测定600nmOD值确定细菌浓度。　　1.2.2角质形成细胞株HaCaT培养　　HaCaT细胞用含10%新生牛血清的1640培养基(无抗生素)，37℃5%CO2孵箱常规培养传代。实验时以1.2×105个细胞·孔-1接种于24孔板，待细胞融合时(≈2.5×105·孔-1)进行实验。　　1.2.3金黄色葡萄球菌在细胞HaCaT内

6、存活的动态观察　　HaCaT细胞用PBS洗三次，加入用1640培养基稀释好的细菌，每孔400μl，细菌与细胞的比例为100∶1，置CO2孵箱孵育2h。用含有庆大霉素(100μg·ml-1)的PBS洗细胞三次，每孔加入含有庆大霉素(100μg·ml-1)及10%新生牛血清的1640培养基1000ul，37℃95%CO2孵箱孵育，以杀死胞外金黄色葡萄球菌。分别于实验4、24、48及72h，用0.25%TritonX100裂解细胞，释放出细胞内的活细菌，用平板菌落计数法计数胞内活菌数。每实验组为3复孔，每孔样

7、品涂2个细菌培养板。　　1.2.4PMA、FSK对HaCaT细胞抗菌作用的影响　　HaCaT细胞用PBS洗三次，加入用1640培养基稀释好的细菌，每孔400μl，细菌与细胞的比例为100∶1，置CO2孵箱孵育2h。用含有庆大霉素(100μg·ml-1)的PBS洗细胞三次，每孔加入含有庆大霉素(100μg·ml-1)、10%新生牛血清及PMA(或FSK)的1640培养基1000ul，培养基中PMA终浓度分别为0(对照)、1μM、2μM、5μM;培养基中FSK终浓度分别为0(对照)、1μM、2μM、5μM。置

8、37℃5%CO2孵箱孵育。在实验开始(加入细菌)后的24h，用0.25%TritonX100裂解细胞，释放出细胞内的活细菌，平板菌落计数法计数胞内活菌数。每个实验组为3复孔。　　1.3统计学处理实验数据以SPSS进行统计学处理，数值以x±s表示。采用t检验。　　2结果　　2.1金黄色葡萄球菌在HaCaT细胞内的动态变化9　　结果显示，24h细菌数量比4h增加16.0%，48h细菌数量比4h减少74.5%，而72h胞内细菌数量