肾母细胞瘤血清蛋白质标记物检测与分期模型构建研究

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1、授予单位代码：!Q璺主呈学号或申请号：Q璺3Q121墨密级：一．金．丑一郑州大学硕士学位论文论文题目：肾母细胞瘤血清蛋白质标记物检测与分期模型构建研究作者姓名：陈新让学科门类：专业方向：导师姓名、职称：医学小儿外科王家祥教授二零零七年四月肾母细胞痼血清蛋白质标记物检测与分期模型构建研究肾母细胞瘤血清蛋白质标记物检测与分期模型构建研究研究生陈新让导师王家祥郑州大学第一临床医学院小儿外科(450052)摘要背景与目的：肾母细胞瘤是儿童最常见的恶性肿瘤之一。全世界15岁以下儿童的发病率约为1／10，000。德

2、国医师Wilms于1899年首次报告此病，因此多数作者称之为Wilms瘤。肾母细胞瘤是小儿最常见的由肾胚基发生的恶性肿瘤，2岁以下发病率最高。儿童恶性肿瘤的死亡率由20世纪80年代的8％上升到了10．7％，d,JI,肾母细胞瘤已经成为d,JL病死的主要原因之一。肾母细胞瘤的l临床病理分期和治疗方法的选择与患儿预后有直接的关系，NWTS在其2001年的总结中提到：在目前的影像学技术条件下(依靠CT等)仍有7．o％的漏诊率【l】，主要是直径小于3cm的肾母细胞瘤。而表面增强激光解析离子化飞行时间质谱技术(S

3、urfaceEnhancedLaserDcsorption／lonizationtimeofflightMassSpectrometry,SELDI-TOF．MS)是近年发展起来的一种新的蛋白质研究技术。具有快速、简便、高通量及对多样本平行检验的优点，质谱技术及生物信息学方法的出现提供了有效筛选特异性标记物的方法。Ciphergen公司研发的SELDI-TOF．MS技术是一项全新的蛋白质组学研究方法，该技术通过应用少量天然蛋白质提取物来进行快速分析，克服了传统分析方法的局限性。具有样品用量小、操作简便、

4、灵敏度高、高通量等优点，己成功将其应用于卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、直肠癌等恶性肿瘤的诊断、肿瘤标志物的筛选及其他蛋白质组学研究中。本组应用该技术在肝癌，甲状腺癌及肾母细胞瘤前期研究中获得满意效果。应用SELDI-TOF-MS技术结合生物信息学和支持向量机(supportvectormachine，SVM)方法，筛选出肾母细胞瘤患儿特异性蛋白质标记物，建立肾母细胞瘤临床分期血清蛋白质指纹图谱模型并与CT分期进行对照分析。材料与方法：(1)血清标本共80例均来自郑州大学第一附属医院小儿外科，其中术前肾

5、母细胞瘤30例，其它d,JL腹恶性实体肿瘤30例(神经母细胞瘤16例，肝母细胞瘤4郑州大学2007年研究生学位论文肾母细胞瘤血清蛋白质标记物检测与分期模型构建研究例，肾横纹肌肉瘤4例，恶性畸胎瘤4例，胰母细胞瘤2例)，正常对照组20例均来自体检的健康小儿．所有的恶性肿瘤均经免疫组化和2名以上病理学教授证实。术前肾母细胞瘤中男2l例，女9例，平均年龄2．10_0．10岁；小儿其它腹部恶性实体肿瘤中男18例，女12例，平均年龄2．50±o．16岁。正常对照组与肾母细胞瘤组年龄性别相配对．所有外周静脉全血标本

6、均于术日前清晨空腹抽取，4℃静置lh后3000rpm离心10min,分离出的血清储存于-80℃低温冰箱中。CT投照方法：西门子SCT机，扫描范围自膈肌上方lcm至肾下极，间隔8nun,层厚8mm．感兴趣间隔5咖，层厚5姗【Il’扫描时间2s。造影剂采用欧乃派克。剂量1．5．2．0ml／kg。(2)样本冰融，4℃10000rpm离心2min；取96孔板，放冰盒上，每孔加U9(9MUrea，2％CHAPS，I％DTO10m，血清5m，4℃层析柜600rpm振荡30min；振荡结束前15rain做芯片预处理，

7、芯片装入Bioprocessor中并记下芯片号；每孔加NaAC(100Mm，pH4)200m，层析柜中600rpm，5min，重复1次；U9处理后96孔板放冰上，快速加入NaACl851d在层析柜中6000rpm振荡2min；加已处理好的样本100pl到芯片，层析柜4℃600rpm振荡Ih，甩干，重复3次；用hplc水200ttl洗2次快速甩干；用50％饱和的SPAlm重复2次；上机检测；将芯片放入Ciphergen读谱仪中检测。(3)用proteinchipsoftware3．1做校正，使总离子的强度

8、及分子量均一化。应用ZUCI-ProteinChipDataAnalyzeSystem软件包进行分析。原始数据用离散小波(undeeimateddiscretewavelettransform)分析去除噪音。并减掉基线。聚类分析以10％为最小阈值，将各个样本中m／z的差异小于O．3％的峰聚为一类。支持向量机(supportvectormachine,SVM)特征向量的选取采用统计过滤结合模型依赖性筛选的方法建立判别模型，用留一法交叉验证作为