肾母细胞瘤细胞株、肾母细胞瘤患儿血清蛋白质检测研究

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1、郑州大学2009届硕士学位论文肾母细胞瘤细胞株、肾母细胞瘤患儿血清蛋白质检测研究肾母细胞瘤细胞株、肾母细胞瘤患儿血清蛋白质检测研究硕士研究生贾佳导师王家祥中文摘要研究背景肾母细胞瘤(nephroblast。ma)又名肾胚胎瘤、wilms瘤(WT)，是儿童最常见的腹膜后实体肿瘤之一。自90年代以来，肿瘤手术切除率近于100.0%，5年生存率达到80.0%。由于肾母细胞瘤为先天性疾病，发病年龄较低，儿童又有其自身特点无法及时准确感知病情，目前尚无行之有效的早期检测手段。临床实践证明，如果能够及早发现，及时治疗，部分术后的肾母细胞瘤患

2、儿可达到临床治愈、长期存活的疗效。目前肾母细胞瘤主要依靠临床症状和超声检查、CT、泌尿系平片、静脉肾盂造影等影像学手段，但这些检查手段只有当肿瘤长到一定大小时才能被发现，敏感性差。此外，当前尚未发现肾母细胞瘤诊断特异性强的生物学标记物。因此，探索一种简单、快速、敏感性高和特异性强的新方法具有重要的临床意义。肾母细胞瘤的发生是多基因多阶段多因素的动力学过程，是癌基因激活和抑癌基因失活的结果，涉及到多个基因，基因突变或调控异常时，细胞内的蛋白质在成份和数量上都会有相应的改变，通过对蛋白质的动态观察可以了解肿瘤是否复发或转移的动态变化

3、。蛋白质组学的发展为肿瘤预后监测提供了新的方法和技术平台。体外培养的细胞株虽然不能完全反映体内细胞的生长状态和生物学活性，但它具有成分单一，均质性好，实验条件容易控制等优点。尤其在做对比性研究时可避免由组织细胞成分复杂，细胞异质性高等缺点造成的结果不真实和不可靠。蛋白质组学的表面增强激光解吸电离一飞行时间质谱(SurfaceEnhaneedLaserDeso印tio可foniz娜onTimeofFlight一MassSPCCtIDmetry，SELDI一TOF一MS)技术是近年开发的新型蛋白质组学技术，它应用基因芯片的设计原理，

4、把层析、质谱等技术合理地与蛋白质芯片结合，可检测出传统方法难以鉴定的蛋白质和多肤，是发现蛋白质标记物的理想方法，具有快速、灵敏、高通量等特点。目前已郑州大学20()9届硕士学位论文肾母细胞瘤细胞株、肾母细胞瘤患儿血清蛋白质检测研究经运用SELDI一TOF一MS技术筛选出了肾母细胞瘤患儿的特异性血清蛋白标记物，并建立了早期诊断、肿瘤分期、术后及预后监测的诊断模型，本研究应用SELDI一TOF一MS技术分析肾母细胞瘤细胞株、正常胚肾细胞株和肾母细胞瘤患儿术前、术后血清中的差异蛋白，检测出差异的蛋白质表达，进一步探讨用于肾母细胞瘤早期

5、诊断的特异性蛋白质标记物，以建立高特异性和敏感性的肾母细胞瘤诊断模型，同时评价该模型对肾母细胞瘤诊断的应用价值。研究目的检测肾母细胞瘤细胞特异的蛋白质标记物，构建用于肾母细胞瘤早期诊断及鉴别诊断的蛋白质图谱模型。材料与方法1.1材料肾母细胞瘤细胞株(G401)和正常胚肾细胞株(CCC一HEK一1)均购自中国协和医科大学基础医学院细胞中心。肾母细胞瘤患者血清标本100例(术前30例、术后70例)，均来自郑州大学第一附属医院小儿外科，所有肾母细胞瘤均经免疫组化和2名以上病理学教授证实。1.2主要试剂和仪器胎牛血清购自杭州四季清生物有

6、限公司。F12培养液购自中国协和医科大学基础医学院细胞中心。胰蛋白酶购自杭州吉诺生物医药技术有限公司。RPMI一1640培养基购自GIBCO公司。标准分子量蛋白m田上er购自MBI公司。考马斯亮兰G一250(CoomassiebrilliantblueG一250)购自美国Amereseo公司。BPI215型分析天平购自德国S叭orious公司。HeraCO:培养箱购自德国GMBH公司。倒置显微镜购自日本Nikon公司。超声细胞粉碎机购自宁波新芝生物股份有限公司。紫外分光光度计ThermoHelios购自美国热电公司。乙酸钠、尿素

7、、Na^e、sPA(sin叩而caeid)、HPLC水、CH人卫S均购自美国promega公司。表面增强激光解析电离一飞行时间质谱(SurfaceEnhanced骊erDesorptin可IonizationTirneofFlight一MassSpectrometry，SELDI一ToF一Ms)pBS11(主要参数:收集范围为1000Da-5000ODa;优化范围为2000Da一20000Da。)和弱阳离子蛋郑州大学2009届硕士学位论文肾母细胞瘤细胞株、肾母细胞瘤患儿血清蛋白质检测研究白质交换芯片(wcxZ)购自美国ciphe

8、rgenBiosystelns公司。蛋白质芯片wCXZ表面结合有弱型阴离子梭基，可以被分析物表面的正电荷基团相互作用(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸等)而捕获蛋白，可用于检测高等电点的蛋白质和生物标记分子。应用软件:proteinchipsoftware3.2.0和B