肾母细胞瘤血清标记物的筛选与鉴定

《肾母细胞瘤血清标记物的筛选与鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、郑州大学博士学位论文肾母细胞瘤血清标记物的筛选与鉴定姓名：贾占奎申请学位级别：博士专业：外科学指导教师：王家祥201205摘要肾母细胞瘤血清标记物的筛选与鉴定博士研究生：贾占奎导师：王家祥教授郑州大学第一附属医院小儿外科郑州450052摘要研究背景肾母细胞瘤(nephroblastoma)又被称为称肾胚胎细胞瘤(wilms瘤，WT)，是全世界儿童最常为见的腹膜后实体肿瘤之一。在小儿腹部恶性实体肿瘤中发病率高，15岁以下青少年的泌尿生殖系肿瘤中有80％以上为wT。目前手术仍是其主要的治疗方法，有数据显示该肿瘤的手术切除率几乎达到100％，其5年生存率也达到近80％左右。研究人员普遍认

2、为该疾病的早期诊断、早期手术切除对于提高患儿长期生存率具有重要意义，同时发现术后复发是影响生存率的重要因素。但是，无论是初发或是术后复发患儿，为了达到临床治愈的目的，及早发现、及时治疗还是非常有必要的。因此我们认为，在该肿瘤的治疗过程中，其术后随访十分重要，通过随访，我们可以较早的发现肿瘤复发、转移的情况，从而采取及时的治疗措施、并最终提高患者的生存率。目前，临床上关于该肿瘤的术后监测主要根据临床症状外加辅助检查，如超声、静脉肾盂造影、CT等来确诊，但这些检查手段的敏感性较差，只有当肿瘤长到一定大小时才能被发现，因此在一定程度上延误了治疗时机。更令人沮丧的是，目前尚未有研究发现用于

3、诊断肾母细胞瘤、同时具有较强特异性的生物学标记物。因此，寻找一种简单、快速、敏感性高和特异性强的用于肾母细胞瘤诊断和预后监测的新方法具有重要的临床意义。任何肿瘤的发生都是一个复杂的过程，基因、环境、个体差异等众多因素都在其中起到了重要作用。正常机体中癌基因和抑癌基因之间存在着平衡，该摘要平衡一旦被打破，往往会导致肿瘤的发生。癌基因激活或者抑癌基因失活是肿瘤发生的原因之一，其过程往往涉及多个基因，当这些基因突变或调控异常时，通过转录和翻译而产生的胞内蛋白质的成分及数量上都会有产生相应的变化，因此有学者推论，我们可以通过动念观察蛋白质进一步了解肿瘤的发生及发展状况，以及有无复发或转移等

4、动态变化。蛋白质组学也成为了首选的实验方法，其目的在于阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式，内容包括鉴定蛋白质的表达、存在方式(修饰形式)、结构、功能和相互作用等，该学科的发展为肿瘤预后监测提供了新的思维和技术平台。近年来，蛋白质组学的发展突飞猛进，在肿瘤标记物检测方面取得了重要的进展，也为肿瘤早期的正确诊断提供了新方法，目前，蛋白质组学技术已经被广泛应用于为多种恶性肿瘤寻找合适生物标记的研究中。在肾母细胞瘤中，研究者多使用表面增强激光解析电离飞行时间质谱(SELDI—TOF．MS)技术进行差异蛋白的筛选，从而发现肾母细胞瘤患儿血清与正常血清中的差异性蛋白以及肾母细胞瘤患儿血清

5、与肾母细胞瘤细胞株总蛋白中的差异蛋白。同时，结合MALDI．TOF．MS、LC．MS／MS等可实现对肿瘤血清中特异性标记物的鉴定。但迄今为止尚未有该肿瘤相关的特异性蛋白质成功应用于临床的报道。我们认为在肿瘤的发生过程中存在的合并症及并发症、以及肿瘤环境特有的炎症和免疫缺陷的情况都参与了肿瘤的发生发展过程，在肿瘤环境下产生的细胞因子及炎症因子等均和肿瘤都存在着一定的相关性，只有排除这些物质的干扰，才能筛选出具有肿瘤特异性的蛋白质标记物。本研究采用在裸鼠体内建立肾母细胞瘤模型的方法，在最大程度上排除了机体本身存在的炎症或其他合并症对肿瘤发生发展产生的影响，同时由于实验组小鼠均接种相同剂

6、量的肿瘤细胞，因此所产生的疾病进展状况相差不大，组内实验对象呈正态分布。在对人体进行数据分析时，往往因为年龄性别或疾病进展状况不同不能得出具有统计学意义的数据，肾母细胞瘤裸鼠模型则克服了这些不足之处。本研究的目的即寻找一种或几种可用于肾母细胞瘤临床标记物的蛋白，其具体方法为：首先应用SELDI．TOF—MS芯片技术对肾母细胞瘤模型小鼠及对照组小鼠血清进行检测，并结合生物信息学对其进行分析处理，筛选出肾母细胞瘤血清特异性蛋白质峰，随后联合HPLC、MALDI．TOF．MS及LC．MS／MS等蛋白质组学技术对这些差异性蛋白质波峰进行分离、纯化、鉴定，最后则应用WesternBlotti

7、ng方法对所鉴定出来的蛋白质进行验证。摘要研究目的筛选、鉴定并验证可用于肾母细胞瘤血清学诊断的特异性蛋白质标记物。材料与方法1细胞培养接种于裸鼠体内的人肾母细胞瘤SKoNEP．1细胞购自上海拜力生物科技有限公司，在含有10％胎牛血清(FCS)的1640培养基中进行培养。2人肾母细胞瘤裸鼠模型的建立对8周龄雄性裸鼠单侧腹壁皮下注射人肾母细胞瘤细胞用以建立肾母细胞瘤裸鼠模型，皮下注射1X106个细胞。25天后观察到肿瘤增大至2-3cm时处死小鼠，取肿瘤组织进行H．E染色确