水蛭素抑制血管平滑肌细胞增殖和内皮细胞损伤及其机理的研究

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1、山东大学博士学位论文水蛭素抑制血管平滑肌细胞增殖和内皮细胞损伤及其机理的研究姓名：王敏申请学位级别：博士专业：内科学（心血管内科）指导教师：崔连群20040428山东大学博士学位论文水蛭素抑制血管平滑肌细胞增殖和内皮细胞损伤及其机理的研究山东大学医学院内科学(心血管内科)博士研究生王敏导师崔连群教授导师组成员朱兴雷教授刘同宝教授陈良华副教授中文摘要组织损伤、血栓形成及内膜增生是动脉粥样硬化和冠状动脉介入术后再狭窄发生、发展的共同的病理生理过程。在该过程中凝血反应具有承上启下的作用。新近研究显示，凝血酶除了将纤维蛋白原变为纤维蛋白参与凝血过程外，还通过激活凝血酶受体引发直接或间接凝血酶

2、介导的分子和细胞间相互作用。伴随凝血过程的瀑布式反应，凝血酶既能使内皮通透性增强，引发一系列血管损伤反应；又具有生长激素样作用，促进血管损伤后增殖反应：还与血小板、蛋白激酶和粘附分子等形成复杂的网络连接，因而凝血酶在动脉粥样硬化和再狭窄形成过程中既起着重要的始动作用，又贯穿于全过程。因此在防治动脉粥样硬化和再狭窄过程中抑制凝血酶是至关重要的。水蛭素来源于医用水蛭唾液腺，为65个氨基酸组成的单链多肽，目前可以利用基因重组技术大量生产，是高效特异性凝血酶抑制剂。它专一性强，用量小，而且对已经与血栓结合的凝血酶也起作用：对凝血酶的抑制不需要借助于抗凝血酶m的作用，对因遗传或后天原因缺乏抗凝

3、血酶III的病人同样有效；它还具有分子量小，不会引起免疫学方面不良反应的优点。除了良好的抗凝作用外，在防治动脉粥样硬化和再狭窄有关因素方面，部分l临床试验和动物实验结果已经显示了良好的开端，但是从细胞和分子生物学水平对其病理生理过程的研究甚少。山东大学博士学位论文本课题旨在用活体细胞体外培养的方法，借助现代细胞和分子生物学研究技术，分别对凝血酶作用于血管平滑肌细胞、内皮细胞和中性粒细胞后引起的反应形式、表现特点、作用途径与环节以及可能的机制，进行系统研究。围绕动脉粥样硬化和介入术后再狭窄病理生理机制探讨：(1)水蛭索是否抑制凝血酶诱导的血管平滑肌细胞增殖；以及通过对细胞生长、细胞周期

4、变化、血小板源生长因子及增殖细胞核抗原的分析，推断可能的作用信号通路。(2)水蛭素是否减少凝血酶诱导血管内皮细胞损伤及其释放基质金属蛋白酶的作用：以及信号转导通路中重要的转录因子⋯核因子一kappaB是否参与上述一系列过程。(3)水蛭素是否降低凝血酶诱导的血液中自细胞激活，以及通过对中性粒细胞和血管内皮细胞粘附分子表达的分析，推断可能的作用途径。本研究用四唑盐比色实验检测细胞生长活性、流式细胞术检测细胞各周期时相分布变化、免疫细胞化学分析检测皿小扳源生长因子(Plateletderivatedgrowthfactor，PDGF)和增殖细胞核抗原(proliferatingcellrl

5、UClearanigen，PCNA)在血管平滑肌细胞的表达，证明凝血酶是促进血管平滑肌细胞增殖的重要因子，体外培养的血管平滑肌细胞经凝血酶诱导后，表现为生长活性增强，细胞周期中处于增殖期的细胞增多，PDGF和PCNA表达增强，水蛭素能显著抑制上述一系列反应。同时用四唑盐比色法证实水蛭素减轻凝血酶诱导的细胞血管内皮细胞的损伤程度：用逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)显示水蛭素抑制凝血酶诱导反映细胞基质变化并且与血管重塑有关的指标-'金属蛋白酶MMP-2、MT卜MMPmRNA的表达：用免疫细胞化学方法和免疫印记法(Westerablot)分析NF一越活化时由细胞浆至细胞核的动态改变，证实

6、上述凝血酶作用于血管内皮细胞一系列反应过程经NF一一B细胞信号转导通路．而且水蛭素对该通路有一定的抑制作用。综上所述，水蛭素在抑制凝血反应的同时，还既能够抑制血管平滑肌细胞增殖，又能减低血管内皮损伤，因此具有一石多鸟的作用，这是迄今为止在防治动脉粥样硬化和介入术后再狭窄方面为数不多的药2山东大学博士学位论文物之一。该实验在细胞和分子生物学水平对凝血酶和水蛭素对平滑肌细胞和血管内皮细胞的影响因素进行了部分探讨，有助于明确早期动脉损伤的发生与发展机制，从而抑制或减缓其病理生理过程的发生、发展，为探索心血管病的发病机制及治疗提供了的途径。本研究分3部分：1．水蛭素对凝血酶诱导血管平滑肌细胞

7、增殖的抑制作用及机理研究目的：观察水蛭素对凝血酶诱导体外培养血管平滑肌细胞增殖的抑制作用及其量效关系。通过对细胞生长、细胞周期变化、血小板源生长因子及增殖细胞核抗原的分析，推断可能的作用信号通路。研究方法：组织贴块法培养获得原代兔胸主动脉平滑肌细胞。2—5传代细胞用于实验，待细胞达亚融合状态后，换无血清培养液使其生长同步。实验因素分成4组：凝血酶(4．0ku／L)组；凝血酶(4．Oku／L)+nk蛭素(6．0ku／L)组；凝血酶(4．Oku／L)+肝素(6