水蛭抑制肿瘤血管生成的作用及其机制的研究

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1、湖北中医药大学学位论文原创性声明本人声明：所呈交的学位论文是在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，本论文不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得湖北中医药大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在论文中作了明确的说明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：巷小角矽哆年岁月27日关于学位论文使用授权的声明本人完全了解湖北中医药大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位

2、论文的全部或部份内容，可以采用复印、缩印或其他手段保留学位论文；学校可以根据国家或湖北省有关部门的规定送交学位论文。同意《中国优秀博硕士论文全文数据库出版章程》的内容。同意授权中国科学技术信息研究所将本人学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》。(保密论文在解密后遵守此规定)论文作者签名：瓠葫导师签名：砩年f月节日灯，＼矾目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯IABSTRACTS⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯IV缩略词表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．Ix前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

3、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1实验研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯32实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯63实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．124讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．14结语⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．26参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．29附录一：实验图片⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．36附录--：综述：中

4、药抗肿瘤血管生成机制的研究现状⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．42附录三：发表的论文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．49致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．5O中文摘要近年来，在肿瘤领域研究的重大进展之一是确立了肿瘤血管生成在肿瘤发生发展过程中的重要作用及意义。相关抗肿瘤血管生成药物也孕育而生，如贝伐单抗、舒尼替尼、索拉非尼等。然而，在临床运用中因所取得的疗效有限，出现耐药，甚至无效，患者所获得的生存期有限，并最终出现肿瘤侵袭和转移，科学家也逐步认识到肿瘤缺氧微环境对肿瘤血管生成的影响，并影响抗肿瘤血管生成药物的作用。现代肿瘤

5、研究中，中医药，亦为肿瘤防治的一种重要策略。研究发现，活血化瘀中药对肿瘤血管生成有重要作用。本课题组在前期，已有相关研究证实水蛭具有抗肿瘤血管生成的作用。故本课题欲进一步从肿瘤缺氧微环境探索水蛭在抗肿瘤血管生成中可能的作用机制，以期为水蛭抗肿瘤研究开辟新的探索途径，为临床运用提供一定的理论依据。目的探讨水蛭能否通过改善肿瘤细胞缺氧微环境来抑制肿瘤血管生成及其相关机制研究。方法采用氯化钴模拟化学缺氧。在缺氧条件下，采用MTT法观察水蛭含药血清对EA．Hy926细胞的增殖抑制作用；采用RT-PCR法检测缺氧诱导因子一1o【(HIF-10【)mRNA、血管内

6、皮生长因子(VEGF)mRNA的表达；WesternBlotting法检测HIF-10c蛋白水平；Matrivgel基质胶模拟体外小管形成实验检测小管生成情况。结果1、缺氧条件下，水蛭含药血清对EA．hy926细胞增殖作用的影响首先设定水蛭含药血清浓度梯度0、5％、15％、25％、35％、45％，观察水蛭含药血清对EA．hy926细胞增殖作用的影响，发现水蛭含药浓度超过35％时细胞明显死亡，可能是药物本身的理化毒性对细胞有影响；水蛭含药浓度在25％时的抑制作用尚无15％浓度的作用显著，可能是由于含药血清中血清的含量亦较高，其抑制作用和促进作用相抵所致；

7、在5％和15％浓度组，其抑制作用随时间延长而逐渐增强，因此以5％和15％浓度组分别作为低、高剂量组。从作用时间上看，在不同水蛭含药血清浓度下，对EA．hy926细胞增殖的抑制率呈现时间依赖性。虽然36h和48h同样有明显的抑制作用，但对于48h的显著抑制作用考虑可能也存在细胞本身凋亡增加，因此后续试验选择药物作用后36h的时间点观察。2、缺氧条件下，水蛭含药血清对EA．hy926细胞HIF一10【mRNA和VEGFmRNA表达的影响缺氧条件下，EA．hy926细胞在水蛭高、低剂量组作用后HIF一10【mRNA和VEGFmRNA的表达明显降低，分别为0．

8、33±0．10、0．50土O．12，O．76±0．14、0．92土0．05，与阴性对照组相比有