蜂毒素体外抑制内皮细胞血管生成及其作用机制

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1、蜂毒素体外抑制内皮细胞血管生成及其作用机制【摘要】目的：探讨蜂毒素对人脐静脉内皮细胞（ECV304）血管生成的抑制作用及其机制.方法：体外培养ECV304细胞，分别测定蜂毒素对其增殖、迁移及形成管状结构的影响.采用酶联免疫吸附法检测血管内皮细胞生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的含量.应用实时荧光定量PCR方法检测ECV304细胞VEGFmRNA和bFGFmRNA的表达.结果：经蜂毒素作用后，ECV304细胞的增殖明显受到抑制，24,48,72h的IC50分别为5.11,4.68,4.40mg/L.蜂毒素低、中、高浓度组和沙利度胺(

2、TLD)组ECV304细胞迁移数目(19.44±6.54),(11.17±2.85),(4.22±1.83)和(18.28±5.29)个，明显低于空白对照组(42.33±9.63)个(P<0.01).蜂毒素低、中、高浓度组及TLD组形成管状结构的面积分别为(5947.22±973.72)，(1558.33±281.06)，(705.85±318.01)和(2928.92±735.67)μm2/视野，均低于空白对照组(7828.94±1202.54)μm2/视野(P<0.01).经蜂毒素处理后，ECV304细胞分泌VEGF及bFGF的功能明显下

3、降.荧光定量PCR证实，蜂毒素可降低ECV304细胞VEGFmRNA和bFGFmRN的表达.结论：体外实验结果表明，蜂毒素具有抑制ECV304细胞血管生成的作用，这种效应与血管内皮细胞VEGF和bFGF的活性降低及其合成受到抑制有关.【关键词】蜂毒素内皮血管新生血管生成抑制剂0引言血管新生在人体正常发育以及许多疾病的发生与发展中起着重要作用，尤其与肿瘤的形成及转移关系密切［1］.新生血管保证了肿瘤持续生长所需营养物质的有效供给.抑制肿瘤的血管新生，切断肿瘤生长和转移所依赖的"命脉"已经成为当前治疗肿瘤的重要策略之一［2］.蜂毒素是从蜂毒中提取的一种小分子

4、肽类物质，既往的研究表明，它对多种肿瘤细胞的增殖具有较强的抑制作用［3-4］，是一个十分具有应用前景的抗肿瘤天然药物，但其作用机制尚不明确.本研究通过体外模拟血管生成，观察蜂毒素对血管内皮细胞的抑制作用，并探讨其作用机制.1材料和方法1.1材料蜂毒素(批号：104K4016)和MTT(美国Sigma公司)；沙利度胺(thalidomide,TLD)(批号：0601181，常州制药厂有限公司)；Transp;Dsystems公司)；经典总RNA提取试剂盒，βactin，VEGF和bFGF引物(上海Sangon生物工程公司)；RealtimePCR反应试

5、剂盒(德国Roche公司)；RNasin(美国Promega公司)；DMEM培养基(美国Gibco公司)；XDS1B型倒置相差显微镜(日本Olympus公司)；Modle500型酶联免疫检测仪(美国BioRad公司)；RotorGeneRG3000型荧光定量PCR仪(澳大利亚CorbetResearch公司)；人脐静脉内皮细胞株ECV304(中国科学院上海细胞研究所).1.2方法1.2.1细胞培养用含有100mL/L热灭活小牛血清的DMEM培养基在37℃，体积分数为50mL/LCO2，饱和湿度条件下常规培养，2～3d传代1次，实验用对数生长期细胞

6、.1.2.2细胞增殖实验取对数生长期ECV304细胞制成单细胞悬液，以每孔1×104/100μL接种于96孔板.在含10mL/L热灭活小牛血清的DMEM培养基中培养24h(50mL/LCO2，37℃).加入含不同浓度蜂毒素的完全培养基100μL，对照组加等量PBS液.每组设6个复孔，常规条件下培养.分别在24，48和72h进行MTT实验：每孔加入质量浓度为5mg/mL的MTT溶液10μL，孵育4h后终止培养.弃去上清，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μL，振荡10min，酶标仪测定A492nm值，参比波长630nm.按下列公式计算蜂毒素对ECV304

7、细胞的增殖抑制率(Inhibitionrate，IR)：IR(%)=［1-(实验组A值/对照组A值)］×100%，同时计算半数抑制浓度(IC50).1.2.3内皮细胞迁移实验在微孔膜小室装置的聚碳酸脂滤膜上、下表面分别涂以5μg基质胶和5μg纤维粘连蛋白，以含1g/L牛血清白蛋白的DMEM培养基为迁移介质.每个小室接种1×105/100μL细胞.实验分组：蜂毒素2，4，8mg/L浓度组，TLD50mg/L浓度组及空白对照组.常规培养24h后，揭下滤膜，用棉签拭去膜内表面细胞，甲醇固定，HE染色.200倍光镜下随机选择5个视野，计数每个视野的细胞数目，取平

8、均值.以迁移细胞数目变化表示蜂毒素对ECV304细胞迁移的影响，并按下列公式计算