ox40l抑制血管平滑肌细胞增殖的实验研究

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1、OX40L抑制血管平滑肌细胞增殖的实验研究杨晓玲1曹成建2王磊2杨安宁3杨程2王艳华2徐华1姜怡邓1,3(通讯作者)(1宁夏医科大学基础医学院宁夏银川750004)(2宁夏医科大学检验学院宁夏银川750004)(3宁夏医科大学心脑血管疾病基础研究重点实验室宁夏银川750004)【摘要】目的构建OX40L真核表达质粒并转染血管平滑肌细胞(VSMCs)，探讨其对VSMCs增殖的影响。方法通过目的基因克隆，构建P-OX40L质粒并转染VSMCs。实验分3组:重组质粒(P-OX40L)转染组、空质粒转染组(pcDNA3.1(+))和空白对照组。将P-OX40L用脂质体2000转染入VSMC

2、s,提取细胞的总RNA和蛋白检测OX40L的mRNA和蛋白表达，并用MTT法检测0X40L对VSMCs增殖的影响。结果经PCR、双酶切和DNA序列分析证实OX40L正确插入pcDNA3.1(+)中，将P-OX40L转染VSMCs后，OX40L的mRNA、蛋白表达均高于空质粒组和空白对照组(P<0.01),同时对VSMCs的细胞抑制率明显高于空质粒组和空白对照组。结论成功构建OX40L真核表达质粒，该质粒可抑制VSMCs的增殖。【关键词】OX40L血管平滑肌细胞增殖【中图分类号】R73-3【文献标识码】A【文章编号】2095-1752(2013)35-0091-03AS是一个多

3、因素的复杂病变，血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecells,VSMCs)的增殖和向内膜下移行是影响AS发生发展的重要环节。OX40L是肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor,TNF)超家族成员，参与了免疫、炎症等过程，是AS的相关基因［1］。但OX40L是否通过影响VSMCs增殖参与AS的过程，目前尚不清楚。木研究通过培养原代VSMCs,构建OX40L的真核表达载体，观察OX40L对VSMCs增殖作用，为进一步研究OX40L在AS中的作用提供基础。1材料方法1.1质粒、细胞及试剂人肠杆菌E.coliDH5a、pcDNA3.1(+)质粒及THP-

4、1细胞由本室保存。DNA聚合酶是Takara公司产品，EcoRI、Hindlll内切酶购自Famentas公司，质粒提取试剂盒、胶冋收试剂盒购自宝信生物，OX40L单克隆抗体为博奥森公司产品，苏余试剂为国产分析纯。1.2人OX40L基因编码区的PCR扩增提取THP-1细胞总RNA并逆转录成cDNAo根据GenBank中报告的人OX40LCDS(登录号：NM_003326)，用Primer5软件设计引物。上游:5’-CCCAAGCTTATGTGCGTGGGGGCTCGGCG-3’,下游：5’-CGGAATTCTCAGATCTTGGCCAGGGTG-

5、3’，在上下游5’端引入EcoRI、Hindin限制性内切酶位点。以cDNA为模板，扩增OX40L基因。1.3P-OX40L的构建与鉴定按照Omega质粒提取说明书提取和纯化pcDNA3.1(+)空质粒，将pcDNA3.1(+)和OX40L基因分别用EcoRI和Hindlll内切酶进行双酶切，胶冋收后按连接试剂盒说明书16°C连接4h,转化E.coliDH5a,经氨苄抗性筛选后挑取阳性重组子摇菌并提取质粒，进行PCR、双酶切和DNA序列分析。1.4原代VSMCs培养取剖宫产术后胎儿脐静脉(来自宁夏医科大学总医院妇产科)，用D-Hank&rSqU0;S液冲洗后

6、剥离外膜及结缔组织，纵向剪开血管，棉签轻轻拭去内膜。将血管条剪成小块，均匀贴于培养瓶底，置37?C、5%CO2孵箱用差速贴壁法行原代培养。约7-10天后，细胞从组织块边缘长出，待细胞达80%融合，用α-actin免疫组织化学鉴定，实验用3-6代细胞。1.5P-OX40L转染入VSMCsVSMCs消化离心后按l×104个/cm3密度接种到6孔板继续培养24h,当细胞生长至60%-70%融合后换无血清培养液，按照LipoFectamine2000说明书转染。分为空白对照组、空质粒转染组和P-OX40L转染组，无血清培养基培养6小吋后，终止转染，继续培养24h，收

7、集细胞并提取RNA和总蛋白，用real-timePCR和Westernblot的方法检测各组细胞OX40L的mRNA和蛋白表达。1.6OX40L对VSMCs增殖的影响取对数生长期的细胞，按l×104细胞/孔接种至96孔板中，用含10%FBS的DMEM培养12h。按1.5的方法将P-OX40L转染细胞，对照组转染等剂量的pcDNA3.1(+)空载体，PBS作为阴性空白对照。转染48h后，每孔加入10μlMTT溶液，4h后弃上清液，每孔加入DMSO100